Felgombolyodási kinetikák, mechanizmusok

Alapkísérletek

• Egyensúlyi felgombolyodásvizsgálatok
  • Egyensúly létrehozása denaturálószer jelenlétében
  • Egyensúlyi hődenaturáció
• Kinetikus felgombolyodásvizsgálatok
  • Fel- vagy legombolyodás indítása denaturálószer jelenlétében (gyors keverés)
  • A folyamat nyomonkövetése ált. optikai úton

• Vannak-e köztes állapotok (köztitermékek)?
  • Egyensúlyi köztitermékek: annyira stabilak, hogy egyensúlyi állapotban észlelhetőek
  • Kinetikus köztitermékek: metastabilak, csak kinetikus mérés során észlelhetőek
  • Ha nincs észlelhető arányban felhalmozódó köztitermék, akkor kétállapotú viselkedésről beszélünk.

Egyensúlyi kísérlet

Denaturálószerrel (D, urea vagy guanidin-hidroklorid, GdnHCl) végezve:

• Fehérjemintákat különböző koncentrációjú (D) denaturálószer-oldatokban állni hagyunk
• A D koncentráció 0-tól töményig terjed (8M urea v. 6M GdnHCl)
• megvárjuk a fel- és legombolyodás egyensúlyának beálltát (órák)
• megmérünk egy optikai jellemzőt, mely érzékeny a konformációra (cirkuláris dikroizmus, fluoreszcencia)

Kétállapotú viselkedés esetén:

szigmoid görbe (S alakú).

Bármely D-nél a legombolyodás egyensúlyi állandója:

ahol I(D), ill. I_F és I_U a mért optikai jellemző D denaturálószer-koncentráció mellett, ill. natív (folded, 0 denaturálószer-koncentráció) és denaturált (unfolded, maximális denaturálószer-koncentráció) állapotban.

K_U-ból a legombolyodás szabadentalpiája:

Kétállapotú rendszernél ez lineáris:

ahol deltaG_U,víz a vízben (D=0) érvényes legombolyodási szabadentalpia,

m_U meredekség: konstans, arányos a legombolyodáskor hozzáférhetővé váló felszín nagyságával.

Az egyenest a D=0 denaturálószer-koncentrációra extrapolálva megkapjuk a deltaG_U,víz értéket, ami a fehérje stabilitásának mértéke vízben.

Hődenaturáció útján

• A fehérjeoldatot lassan melegítjük, időt hagyva az egyensúly mindenkori beállására
• Optikai jellemzőt vagy hőelnyelést mérünk
• Optikai jellemzőnél: kiértékelés hasonló, mint a denaturálószernél; Van't Hoff-plotok
• Hőelnyelés mérésénél (kalorimetria): minden termodinamikai mennyiség számítható.
  • Tipikus hőkapacitásgörbe:
    
  • kalorimetrikus entalpia: görbe alatti területből
  • Van't Hoff-entalpia: a görbéből, kétállapotú átmenetet feltételezve

Az egyensúlyi legombolyodás kétállapotúságának feltételei

1. A denaturálószeres mérési adatoknak illeszkedniük kell a kétállapotú átmenetre jellemző görbére (szigmoid, ill deltaG-ben egyenes).
2. Az átmenetnek függetlennek kell lennie az állapot nyomonkövetésére használt, mért jellemzőtől (fluoreszcencia, elnyelés, CD, NMR, stb.)
3. A Van't Hoff-entalpiának meg kell egyeznie a kalorimetrikus entalpiával

Kinetikus kísérlet

A sebességi állandók mérése

• A teljes jellemzéshez különféle denaturálószer-koncentrációk mellett mérjük a fel- vagy legombolyodás sebességét:
  • Alacsony denaturálószer-koncentrációknál felgombolyodási kísérleteket végzünk: teljesen denaturált állapotból hirtelen kihigítjuk a denaturálószert úgy, hogy alacsony legyen a koncentrációja
  • Magas denaturálószer-koncentrációknál legombolyodási kísérleteket végzünk: teljesen natív állapotból denaturálószer hirtelen hozzákeverésével indítjuk a folyamatot
• A keverés után valamilyen optikai jel (pl. fluoreszcencia, cirkuláris dikroizmus, abszorpció) időfüggését mérjük.
• A mért jel időfüggésére exponenciális lecsengések összegét illesztjük:
  I(t) = I₀+A₁exp( - k₁t) + A₂exp( - k₂t) + ...

  (itt t az időt jelenti!)

• A_i : amplitúdók, k_i : sebességi állandók (vagy tau_i=1/k_i időállandók)
• Ha egy exponenciális elég, akkor monofázisos az időfüggés, ha kettő kell, akkor bifázisos, stb.
  

A kinetika elméleti leírása és a mérés értékelése kétállapotú rendszernél

• Kétállapotú viselkedésnél a natív és a denaturált állapotot egymástól egyetlen energiagát választja el, ez az átmeneti állapot.
• Ha van egy átmeneti állapot (jele: t, transition state), feltehetjük, hogy annak szabadentalpiája is lineárisan függ a denaturálószer-koncentrációtól:
  G_t(D) = G_t,víz - m_tD

  és m_t-vel jelöljük a függés meredekségét.

  

  (mindent a felgombolyodott állapothoz viszonyítva (G_F-et tekintsük 0-nak bármely D-nél) a delták elhagyhatók; az ábrán még RT-vel is osztották a szabadentalpiákat, ezt most hagyjuk figyelmen kívül).

• A fel- és legombolyodás sebességi állandói az aktiválási energiáktól függenek:
  • A legombolyodás aktiválási energiája: G_t, így
    k_le = k' exp( - G_t/RT)
  • A felgombolyodás aktiválási energiája: G_t - G_U, így
    k_fel = k' exp( -(G_t - G_U)/RT)
• Kinetikai mérésnél az egyensúlyból való kibillenés (a denaturálószer-koncentráció hirtelen megváltozása) utáni relaxáció (új egyensúlyi állapot felvételének folyamata) sebességét mérjük. Ennek megfigyelhető sebességi állandója (ezt kapjuk meg az optikai jel időfüggéséből a fentebb leírt illesztésből):
  k_megfigy = k_fel + k_le
• A D-től való függést bevive és az egyenlet logaritmusát véve kapjuk:
  ln k_megfigy = ln (k_fel,víz exp((m_U - m_t)D) + k_le,víz exp(- m_t D))
• Ezt mérési adatok alapján ábrázolva kapjuk az ún. chevron plotot:
  

  Jellegzetes, V alakú plot (chevron: fordított V alakú katonai rangjelzés). A V alak abból adódik, hogy alacsony denaturálószer-koncentrációnál a felgombolyodás, magasnál a legombolyodás sebessége nagy, közepesnél mindkettő kicsi.

• Jobb oldali ág: legombolyodási ág (legombolyítással mérhető), meredeksége -m_t, tengelymetszete ln k_le,víz
• Bal oldali ág: felgombolyodási ág (felgombolyítással mérhető), meredeksége m_U - m_t, tengelymetszete ln k_fel,víz
• A mérésből meghatározható m_t és m_U. (Az m_U egyensúlyi mérésből is, ld. fentebb.)
  • m_t arányos az átmeneti állapotban hozzáférhetővé váló felszínnel
  • (m_U - m_t)/m_U az átmeneti állapot pozícióját jellemzi (hol van a reakciókoordinátán)
• D denaturálószer-koncentráció: valójában az aktivitással kell(ene) számolni, ez nemlineáris függvénye a koncentrációnak, néha alkalmazzák

A kinetika kétállapotúságának feltételei

1. A fel- és legombolyodásnak is monofázisosnak kell lennie
2. ln k_megfigy -nek a fenti egyenlet szerint kell függnie a denaturálószer-koncentrációtól: a chevron plot mindkét ágának egyenesnek kell lennie.
3. A kinetikus kísérletekből számolt paraméterek értékeinek (egyensúlyi állandó K_U=k_fel/k_le, m_U=[felgombolyodási ág meredeksége] + [legombolyodási ág meredeksége]) meg kell egyeznie az egyensúlyi kísérletekből nyert értékekkel.

Példák kétállapotú viselkedést mutató fehérjékre

Példa: Kimotripszin inhibitor 2

Szerkezete

64 aminosav, egy négyszálú béta-lemez és egy hélix

Egyensúlyi kísérlet

Az egyensúlyi kísérletben pontosan illeszkedik a kétállapotú modellre.

Kinetikai kísérlet:

A kinetikai kísérletben is pontosan illeszkedik a kétállapotú modellre. Inzert: ugyanez barnázon kimérve (a felgombolyodási ág nemlineáris --> nem kétállapotú viselkedés).

Egyetlen kooperatív egység. Egyéb kísérletek kimutatták: a másodlagos és a harmadlagos szerkezet egyidejűleg alakul ki, a hierarchikus modell itt nem teljesül! A kimotripszin inhibitor 2 minden tekintetben tökéletesen kétállapotú viselkedést mutat.

Egyéb, kétállapotú viselkedést mutató fehérjék

• Számos kis, egydoménes fehérje, pl.
  • Alfa-helikális fehérjék: monomerikus lambda represszor, citokróm c (speciális körülmények között)
  • Béta-fehérjék: tendamisztát, CspB hidegsokk-fehérje, SH3 domének
  • Béta-szendvicsek: twitchin, tenascin, stb.
  • Alfa/béta fehérjék: Kimotripszin inhibitor 2, Arc represszor, ubiquitin (pontmutáns), villin, stb.
• Nagy változatosságot mutatnak k_fel-ben is és az átmeneti állapot pozíciójában is
• Legfeljebb kb. 100 aminosavrészből állnak (a legnagyobb 107).
• Némely esetben a kétállapotú viselkedés könnyen megszüntethető (mutáció, körülmények változtatása)
• A felgombolyodás kinetikai paramétereit elsősorban a fehérje topológiája határozza meg (hasonló topológia --> hasonló paraméterek)
• Másodlagos szerkezet: alfa-helikális fehérjék gyorsabban gombolyodnak-e fel, mint a béta-szerkezetűek? Van korreláció, de sok a kivétel.
• Lokális/nemlokális kontaktusok száma összefügg-e a felgombolyodási sebességgel? Van némi korreláció. (Több nemlokális kontaktus --> lassúbb gombolyodás)

Többállapotú viselkedés

Példa: lizozim és a foszfoglicerát kináz (PGK) izolált N-terminális doménje

PGK N-domén (175 aminosav)

Egyensúlyi kísérlet:

GdnHCl denaturáció

Szigmoid görbe, az egyensúly kétállapotú

Kinetikai kísérlet:

Fent: a fel- és legombolyodás relaxációs görbéi: monofázisosak

Lent: a chevron plot felgombolyodási ága nemlineáris --> kétállapotú modellnek nem felel meg.

Az adatok illeszthetőek háromállapotú modellre: U = I = F

Lizozim (129 aminosav)

Szerkezet

Tyúktojás-lizozim: egy alfa és egy béta domén

Egyensúlyi kísérlet:

szigmoid görbe, kétállapotú egyensúly

Kinetikai kísérlet

• (a): 5,4-ről 0,49 M GdnHCl-re higítás. Háromfázisú kinetika: (1) Ugrásszerű csökkenés (holtidőben), (2) gyors csökkenés, (3) lassabb emelkedés
• (b): 5,4-ről 2,8 M GdnHCl-re higítás. Egyfázisú kinetika, lassú.
• (c): Denaturációs átmenetek: sima egyfázisú görbék

Chevron plot: ha több fázis van, mindegyik fázis sebességi állandója alapján készíthetünk chevron plotot:

• Felső görbe a gyors, alsó a lassú fázisok sebességi állandói alapján
• Felgombolyodási ág nemlineáris --> nem teljesül a kétállapotú kinetika
• Az adatok négyállapotú modellre illeszthetők: U = I = I^* = F

A lizozim felgombolyodása tehát különösen komplex: négyállapotú felgombolyodás!

Szabadentalpia-profilok

A mérések alapján meghatározható az átmeneti állapotok és a köztes állapotok szabadentalpiája és reakciókoordinátán vett pozíciója (reakciókoordináta: a natív állapotban eltemetett felszínek hozzáférhetősége az adott állapotban, ez az m_U és m_t értékekből származtatható). A PGK-ra és a lizozimre a fenti mérések alapján a következő szabadentalpia-profilok adódnak:

Egyéb, többállapotú viselkedést mutató fehérjék

• A 100 aminosavnál hosszabb fehérjék általában, pl. barnáz, lizozim, GroEL chaperonin apikális doménje, ribonukláz H, izolált PGK-domének, citokróm c (bizonyos körülmények között)
• Nem különböznek lényegesen a kétállapotúan gombolyodó fehérjéktől sem a sebességi állandókban, sem az átmeneti állapot pozíciójában, sem a térszerkezet komplexitásában
• Általában nagyobb a stabilitásuk, mint a kétállapotúaknak
• Néha stabilizálással kétállapotú fehérjét háromállapotúvá, destabilizációval háromállapotút kétállapotúvá lehet alakítani
• A felgombolyodást kinetikus csapdák, hibásan gombolyodott köztitermékek komplikálják

Hidrogénkicserélődéses módszerek

Hidrogénizotóp-kicserélődés

• Fehérjét nehézvízbe helyezve a labilis protonok deuteronra (deutérium magja) cserélődnek.
• A kicserélődés sebességi állandója (teljes hozzáférés esetén):
  k_c = k_H[H⁺] + k_OH[OH^-]

  sav- és báziskatalizált, minimuma pH=3-nál (pH=3-nál a leglassúbb, ettől eltérve gyorsul)

• Denaturált fehérjénél oldalláncok szekvenciafüggő módon befolyásolják a kicserélődést.
• Felgombolyodott fehérje belsejében lévő protonnak előbb felszínre kell kerülnie.
  

  (U a denaturált, F a natív állapot, H a hidrogén, D a deutérium)

• Ha a felgombolyodott állapot energetikailag erősen kedvező, akkor k_f >> k_u, így a megfigyelhető kicserélődési sebesség:
  k_ex = k_uk_c/(k_f + k_c)

  Két határeset:

  • EX₂ mechanizmus: k_f >> k_c esetén: szerkezeti fluktuáció gyors a kicserélődéshez képest (kicserélődés-limitált mechanizmus). Ekkor
    k_ex = K_opk_c

    ahol K_op a protont rejtő hely felnyílásának egyensúlyi állandója. Reciproka: P=k_c/k_ex a védettségi tényező. A kicserélődés sebességét az éppen kinyílt állapotban lévő proton relatív koncentrációja határozza meg. Sok kinyílás kell egy kicserélődéshez.

  • EX₁ mechanizmus: k_f << k_c esetén: szerkezeti fluktuáció lassú a kicserélődéshez képest (felnyílás-limitált mechanizmus). Ekkor
    k_ex = k_u

    a kicserélődés sebességét a kinyílási sebesség határozza meg: minden kinyíláskor csere van.

• EX₂ a leggyakoribb eset. EX₁ akkor valósul meg, ha a fehérje destabilizált (lassan gombolyodik fel) vagy ha erősen bázikus a pH (gyors a kicserélődés).
• A két mechanizmus elkülönítése: pH-függés alapján.
  • EX₂-nél a k_c erős pH-függése jelenik meg
  • EX₁-nél csak k_u esetleges pH-függése

Pulse-labelling (impulzusjelöléses) hidrogénkicserélődés

teljesen deuterált, denaturált fehérje (előzőleg nehézvizes denaturálószerben áztattuk sokáig) elindítjuk a felgombolyodást, majd adott tf idő múlva magas pH-n egy adott időtartamú, H2O-val készített pufferlökettel (impulzus) megjelöljük a hozzáférhető protonhelyeket (ezeken a helyeken a deuteronok protonokra cserélődnek). Ezzel lényegében pillanatfelvételt készítünk a fehérje adott állapotáról. alacsony pH-jú pufferrel megállítjuk a kicserélődést, hogy a védettebb deuteronok megmaradhassanak (a H-kötésben lévők). (Ha hagynánk a magas pH-jú puffert, egy idő után mindegyik deuteron protonra cserélődne.) hagyjuk befejeződni a felgombolyodást a jelölt mintát NMR-rel vagy tömegspektroszkópiával vizsgáljuk: NMR-rel a kicserélődött protonok helye azonosítható, tömegspektroszkópiával a számuk és heterogén minta esetén az eloszlásuk is A kísérletet tf változtatásával sokszor megismételjük, így pillanatfelvételeket készítve a felgombolyodás folyamatáról, különböző időpontokban.

Kísérleti elrendezés:

S1: denaturált fehérje nehézvízben
S2: visszagombolyító puffer
S3: impulzuspuffer (magas pH, H₂O
S4: leállító puffer (alacsony pH)
M1, M2, M3: keverések
t_f: visszagombolyodási idő (a jelölés előtt)
t_p: impulzusidő

Koncentrációváltozások az idő függvényében:

Mért mennyiség:

• a fehérje egyes régióiban lévő protonok jelölhetősége a felgombolyodásra hagyott idő függvényében. (Minél hosszabb ideig hagyjuk menni a felgombolyodást a jelölés előtt, annál kevesebb molekulában lesznek még hozzáférhetőek a jelölhető protonok, tehát a jelölhetőség csökken!)
• az egyes protonok védettségi tényezője (ez növekszik a felgombolyodási idő előrehaladtával)

Példák a felgombolyodás részletes jellemzésére

Lizozim felgombolyodásának vizsgálata

Impulzusjelöléses hidrogénkicserélődés, NMR-rel követve

Különböző régiók jelölhetőségének csökkenése az idő függvényében:

• A görbék nem esnek mind egybe --> vannak intermedierek
• Bifázisos görbék
  • Gyors fázis: 7 ms körüli időállandó. Amplitúdója a hélixeknél 40%, a béta-doménnél csak 24%
  • Lassú fázis: a hélixeknél <100 ms időállandó, a béta-doménnél >100 ms
  • az alfa-domén minden görbéje kb. ugyanolyan, mindkét fázis --> a domén magja kialakulhat, miközben a béta még nem stabilizálódott
• Szekvenciális események vagy párhuzamos utak?
  A bifázisos görbék két lehetséges magyarázata:
  1. A gyors fázisban az adott proton az összes molekulában részleges védettséget szerez, egy gyengén stabil köztitermékben. Ez a lassú fázisban alakul át stabilabb szerkezetté. (Egy közös út.)
  2. Az adott amidcsoport a molekulák egy részében teljes védettséget szerez, a többiben semmit. Az utóbbi frakció a lassú fázisban szerzi meg a védettséget. (Két párhuzamos út.)
  Hogyan különíthető el?
  • 1. esetben EX₂, 2. esetben EX₁ mechanizmus működik, így a két eset a pH-függés alapján elkülöníthető. Eredmény:
    
  • Többnyire nincs kivehető pH-függés --> több párhuzamos út van

Cirkuláris dikroizmus, stopped-flow méréssel

• Felső: távoli UV-tartomány (másodlagos szerk.). Három fázis:
  1. Megugrás a holtidőn belül (2 ms). Hélixtartalomra utal.
  2. További változás kb. 80 ms-ig. A natív értéken túllő (vsz. diszulfid kromofórok miatt). Időállandó nem esik egybe a hidrogénkicserélődésnél mértekkel.
  3. A natív szint elérése 300 ms időállandóval (béta-domén lassú fázisának felel meg)
• Alsó: közeli UV-tartomány (harmadlagos szerk.). Két fázis:
  1. Gyors (amplitúdó 32%), időállandó 10 ms
  2. Lassú (amplitúdó 68%), időállandó 285 ms

  A béta-domén hidrogénkicserélődéséhez hasonló fázisok.

Impulzusjelöléses hidrogénkicserélődés tömegspektroszkópiával mérve

(electrospray ionization mass spectrometry)

Jól látható a köztes állapotok heterogenitása. Egy köztitermék különösen nagy mennyiségben található, ebben az alfa-domén már létrejött, a béta nem.

Egyéb mérések

triptofánok fluoreszcenciája, fluoreszcencia quenching, ANS-kötés, inhibitorkötés, stb.

Az összkép:

1. Legkorábbi állapot (<2 ms): részlegesen összeesett, fluktuáló, jelentős másodlagos szerkezet, nincsenek stabil harmadlagos kölcsönhatások.
2. Az alfa-doménben stabil szerkezet alakul ki, a béta-domén még instabil és fluktuáló. Kis mennyiségben feltűnik egy másik köztitermék is, amiben mindkét domén megvan, de még nem álltak össze natívvá
3. 200 ms: túlnyomórészt majdnem kész alfa-domént tartalmazó köztitermékek. Lassú folyamatban (350 ms időáll.) kialakul a béta-domén és mindkét domén magjának finomszerkezete.

A molekulák 25-30%-a gyorsan gombolyodik (ezeknél 5-10 ms időállandóval mindkét domén létrejön), 70-75%-a lassan (ezeknél a béta domén csak lassan alakul ki).

Citokróm c felgombolyodásának vizsgálata

Szerkezete: helikális, hem csoporttal

Cirkuláris dikroizmus stopped-flowval

• Távoli UV: holtidőn (4 ms) belül a változás 45%-a megtörténik, majd kétfázisú görbe
• Közeli UV: nincs gyors változás, mintegy 100 ms-ig alig változik, utána lassú lecsengés

Különféle mérések

• Gyors időállandóval fejlődik:
  • Távoli UV CD (másodlagos szerkezet)
  • N- és C-terminális hélixek amidprotonjainak védettsége -- a mért értékek hasonlósága arra utal, hogy ezek korán asszociálódnak
  • Trp 59 fluoreszcenciájának kioltása a hem csoport által (gyors kollapszusra utal)
• Lassú időállandóval fejlődik:
  • Közeli ultraibolya tartományban a cirkuláris dikroizmus (harmadlagos szerkezet)
  • Lánc közepén lévő hélixek amidprotonjainak védettsége

Burst-fázis: holtidőn belül a legtöbb fehérjénél megugrás a távoli UV CD-ben. Újabb eredmény: ez lehet az oldatcserétől is, nem feltétlenül tükröz szerkezeti változást.