"Olvadt gombócok" és más kompakt denaturált állapotok

Egy kis tudománytörténet

• 70-es évek eleje: Oleg Ptitsyn megjósol egy állapotot, ahol a másodlagos és harmadlagos szerkezetek már megvannak, de az oldalláncok nem illeszkednek szorosan
• 1973-74 körül: első kísérleti jelek (szénsav anhidráz CD-spektruma)
• 1977: Kuwajima részletesebb vizsgálatai alfa-laktalbuminnal: a hélixek előbb alakulnak ki, mint a szerkezet magasabb szintjei; úgy véli, a köztes állapot nem kompakt
• 1978-tól: Ptitsyn és kutatócsoportja számos különféle módszerrel vizsgálja az alfa-laktalbumin savindukált intermedierjét. Kimutatják, hogy kompakt, de a hődenaturációja nem kooperatív, az oldalláncok szabadok: olvadt, globuláris állapot.
• 1981: Ptitsynék fölfedezik az alfa-laktalbumin termikus intermedierjét
• 1982: Shakhnovich, Finkelstein: az olvadt gombóc állapot elméleti modellje (folyadékállapothoz hasonlítja)
• 1983: Ohgushi és Wada bevezetik a "molten globule" (olvadt gombóc) elnevezést
• 1984: Ptitsyn csoportja kimutatja a szénsav anhidráz kinetikus intermedierjét, kimutatva, hogy ez fő tulajdonságaiban megegyezik az egyensúlyi olvadt gombóccal
• 1987-től: a tudományos közösség kezdi elfogadni, hogy léteznek köztes állapotok
• 1990-től: kételyek azt illetően, hogy az olvadt gombóc önálló termodinamikai állapot-e
• 1993 körül: a kinetikus és egyensúlyi köztes állapotok összehasonlításai
• 1993-95-től: olvadt gombóc élettani szerepének vizsgálatai
• 1994-95: Pre-olvadt gombóc és nagy rendezettségű olvadt gombóc állapotok felfedezése
• 1995-től: további kutatások: szerkezet, élettani szerep, felgombolyodásban játszott szerep

Az "olvadt gombóc" modell

• globuláris formába kondenzálódott
• natívszerű másodlagos szerkezetet mutat
• nemspecifikus hidrofób kölcsönhatások stabilizálják, a hidrofób oldalláncok főleg belül vannak
• topológiája közel van a natív szerkezetéhez
• "olvadt" jellegű, vagyis nincs merev harmadlagos szerkezete, az oldalláncok nem illeszkednek szorosan, a teljesen legombolyodott állapotba való átmenete nem kooperatív

Egyensúlyi köztitermékek

• Kondenzált, Stokes-sugara egyenlő a natív fehérjéével vagy csak kicsit nagyobb
• jelentős másodlagos szerkezetet mutat (távoli UV CD mutatja), bár az ezt stabilizáló H-kötések gyengék
• a legtöbb oldallánc szabad, nem képez harmadlagos kontaktusokat
• a molekula "ragadós": sok hidrofób oldallánc érintkezik a vízzel
• ha enzimről van szó, ebben az állapotban az nem aktív
• a legombolyodott állapotba való átmenet nem vagy kevéssé kooperatív

Kimutatás

Egyensúlyi denaturáció alapján

• Kétállapotú átmenetnek nem megfelelő görbe
• Különböző tulajdonságokat követve nem ugyanaz a középpont

Savas intermedierek

• CD-vel mért optikai tulajdonságaik hasonlóak a denaturálószeres intermedieréhez, de
• nincs mellettük nagy hányadban natív vagy denaturált fehérje, ezért jól vizsgálhatóak
• pl. szénsav anhidráznál, alfa-laktalbuminnál

Termikus intermedierek

• Több fehérjénél kimutatták, hogy a hődenaturált állapot nem teljesen legombolyodott, hanem OG jellegű, jelentős másodlagos szerkezettel
• Denaturálószerrel újabb kooperatív átmenetre bírható
• Lehet, hogy a legtöbb fehérje ilyen

Kompaktság

A méretre, kompaktságra lehet következtetni:

• Viszkozitásméréssel

  
  alfa-laktalbumin különböző állapotainak viszkozitása

• Röntgenszórásból

  

  Citokróm c különféle állapotainak Kratky-plotja. 1: natív áll., 2,3: olvadt gombócok, 4: denaturált áll.
• Méretkizárásos kromatográfia (gélkromatográfia)
  
  béta-laktamáz natív, olvadt gombóc és denaturált állapotának elúciós profilja
• szedimentációs sebesség
• diffúziós együttható (fényszórásból vagy polarizációs interferometriával)
• urea gradiens gélelektroforézis

Másodlagos szerkezet

A másodlagos szerkezeti összetétel a távoli ultraibolya tartományban végzett cirkuláris dikroizmus méréssel határozható meg.

• Távoli UV CD jelentős másodlagos szerkezetet mutat

  

  (a) alfa-laktalbumin távoli UV CD spektrumai. N: natív, A: savas OG, T: termikus OG (90 Celsius), U: denaturált.
  (b) alfa-laktalbumin natív és savas OG állapotának infravörös spektruma

  A CD spektrumoknál mutatkozó eltérés az OG és natív állapotok között főleg az aromás és diszulfid járulékokból adódik, hiszen az infravörös spektrum nem mutat különbséget.

• Egyes fehérjéknél van némi különbség a másodlagos szerkezetben az N és OG állapotok között

Harmadlagos szerkezet

Oldalláncok környezete, mozgási szabadsága

• NMR-spektrumból
  
  béta-laktamáz különböző állapotainak NMR-spektrumai. (a) aromás régió, (b) alifás régió

  Az alifás csoportok sokkal szabadabbak az OG-ben, mint a natívban, az aromásoknál megmaradt némi korlátozottság

• Közeli UV CD: nagymértékben csökkent a natívhoz képest. Nincs merev harmadlagos szerkezet
• NMR spin echo, fluoreszcencia polarizáció: ugyanezt adják

Nagyléptékű fluktuációk

• Hidrogénkicserélődés sebessége nő
• Proteázokra való fogékonyság nő

Nagyban megnövekedett fluktuációkra utal

Hidrofób felületek

Vegyületek, melyek hidrofób felületekhez kötődnek:

• ANS (8-anilino-naftalin-1-szulfonát): kötődéskor nagymértékben megnő a fluoreszcenciája.
  Natív állapotban a szabad hidrofób foltokhoz kötődik. Az olvadt gombócokhoz nagymértékben kötődik
  
  
• 3-trifluorometil-3-m-[¹²⁵I]jódfenil-diazirin és [³H]diazofluorén (DAF): fotoaktiválható hidrofób reagensek.
  Nagymértékben kötődnek az olvadt gombócokhoz

Az olvadt gombócoknak nagy hidrofób felületük miatt a membránokhoz is nagy az affinitásuk

Topológia

• Olvadt gombócról röntgenszerkezet nincs, NMR-spektrumok értelmezése nehéz
• pH-ugrásos hidrogénkicserélődéses kísérlet:
  • Savas olvadt gombóc állapotban nehézvízbe téve a fehérjét különféle időtartamokig hagyjuk menni a kicserélődést
  • A pH-t hirtelen megnöveljük, a fehérje natívvá válik
  • NMR-rel meghatározzuk a kicseréletlen protonok helyét

  Eredmények:

  • A védettségi tényezők sokkal kisebbek, mint a natív állapotban (10⁸ helyett 100-1000 körüliek)
  • Egyes régiók védettséget mutatnak:
    
    Citokróm c, az OG állapotban védett régiók satírozva
    
    Mioglobin, az OG állapotban védett régiók satírozva
  • Olyan régiók mutatnak védettséget, amelyek a natív szerkezetben klasztereket képeznek --> feltehetően az OG-ben is
• A távoli UV CD spektrumok nagyon hasonlóak --> a védettséget nem mutató hélixeknek is meg kell lenniük, csak azok erősen fluktuálnak

Natívszerű-e a harmadlagos szerkezet?

• Deszpentapeptid-inzulin (egy öt aminosavnyi szakaszt töröltek az inzulinból): OG állapotának kétdimenziós NMR vizsgálatát elvégezték. Következtetések:
  • Megvannak a hélixek és a béta-szálak
  • Egymáshoz képest nagyjából úgy helyezkednek el, mint a natív szerkezetben
  • De erősen fluktuálnak (egymáshoz képest)
• Diszulfidhidas kísérletek: a diszulfidhidakat felbontva ugyanúgy képződnek-e újra az OG állapotban, ahogy a natívban kell?
  • alfa-laktalbumin: sokféle diszulfidvariáció
  • béta doménjétől megfosztott alfa-laktalbumin: dominánsan natívszerű diszulfidképződés
  • ellentmondó eredmények, vélemények

Fehérjék víz-alkohol keverékben

• Számos fehérje OG tulajdonságokat mutat víz-alkohol keverékben
• Jelentős másodlagos szerkezet
• Némelykor ott is hélixek vannak, ahol a natív szerkezetben nem (az alkohol helicitást indukál)
• Óvatosan kezelendők az eredmények, mert nem tudni, mennyire esik egybe az alkoholos OG 3D szerkezete a klasszikus OG-ével

Pre-"olvadt gombóc" állapot

• béta-laktamáz egyensúlyi denaturációjában 4 Celsius-fokon két intermediert találtak
  
  béta-laktamáz
• az egyik a szokásos OG
• a másik egy lazább szerkezet:
  
  béta-laktamáz különféle állapotainak részarányai a denaturálószer-koncentráció függvényében
  • jelentős másodlagos szerkezet, de nem annyi, mint az OG
  • kompakt, de nem annyira, mint az OG
  • köti az ANS-t, de nem annyira, mint az OG
• hasonlót találtak szénsav anhidráznál
• felgombolyodásban korai intermedier lehet?

Nagy rendezettségű olvadt gombóc állapot

• Interleukin-4 savas állapota: CD és ANS-kötés szerint OG
• NMR-spektroszkópiából számolt rendezettségi paraméterek szerint csak az egyik hélix vége lazult fel, a hidrofób mag nagy része megmaradt:
  
  Interleukin-4, a fellazult rész sárgával
• Több más fehérjénél kimutattak hasonlót (lólizozim, Staphylococcus nukleáz, apocitokrómok)
• Felvetették, hogy a felgombolyodásban késői intermedier lehet
• De: amely fehérjéknél ezt kimutatták, azoknál hagyományos OG állapotot nem találtak --> ez talán csak egy másfajta OG

Kinetikus intermedierek

• Felgombolyítási kísérletek leggyakoribb eredménye: a távoli UV CD gyorsan kialakul, az aromás oldalláncok környezete és az enzimaktivitás jóval lassabban.
• Tehát: másodlagos szerkezettel rendelkező intermedier halmozódik fel (I)
• Az I a felgombolyodásban a fő energiagátat, a sebességmeghatározó lépést előzi meg:
  U --(gyors)--> I --(lassú)--> N

• Kondenzálódott (kompakt)
• másodlagos szerkezete van
• kevés benne a kialakult harmadlagos kölcsönhatás
• "ragadós"
• ha enzimfehérjéről van szó, akkor inaktív
• ideiglenesen létezik, a felgombolyodás sebességmeghatározó lépése előtt

Kompaktság

• Viszkozitásmérés, ureagradiens-elektroforézis, méretkizárásos kromatográfia --> az I állapot kompakt, Stokes-sugara 10-15%-kal nagyobb a natív állapoténál
• Ureagradiens-gélelektroforézis:

  

  béta-laktamáz stabil OG állapotát vitték a gélre (H). U: legombolyodott, N: natív, I: kinetikus intermedier

• Méretkizárásos kromatográfia:
  
  béta-laktamáz stabil OG állapotát natív pufferbe helyezve alacsony hőmérsékleten elindították a felgombolyododást, majd időnként kromatogramot vettek fel. A stabil OG állapot 13,4 ml-nél jönne le, ez nem jelenik meg, csak a 14,8-nál lejövő I és lassan a 15,3-nál lejövő N.
• Béta-laktamáznál és szénsav anhidráznál jól megkülönböztethető az I a stabil OG-tól. Kissé kompaktabb.

Másodlagos szerkezet

• Stopped-flow CD-mérések --> natív másodlagos szerk. nagy része ms-os időskálán kialakul
• Alfa-laktalbumin: a stabil OG és az I távoli UV CD-spektruma azonosnak adódott
• Interleukin 1-béta (béta-fehérje):
  • távoli UV CD: natív másodlagos szerk. 1 s-on belül kialakul
  • pulse labelling hidrogénkicserélődés:

    

    fekete pöttyök: 1 s alatt levédődnek, fehér pöttyök: csak 25 s után védődnek le

    tehát: kialakul a másodlagos szerk., de a H-kötések még labilisak

• Összefoglalva: nagyon hasonló a stabil OG-hez

Harmadlagos szerkezet

Oldalláncok környezete és mozgékonysága

• NMR-spektrumok: gyakorlatilag megegyeznek az egyensúlyi OG-ével
  
  béta-laktamáz különböző állapotainak NMR-spektrumai. (a) aromás régió, (b) alifás régió
• közeli UV CD: ugyanez

Hidrofób felületek

• ANS-fluoreszcencia követése stopped-flow felgombolyításnál

  

  Öt fehérje ANS-fluoreszcenciájának változása a felgombolyodás során (közben időskála-váltás)

• ANS-kötés előbb gyorsan nő, majd lassan csökken

Topológia

• Pulse labelling hidrogénkicserélődéses kísérletek szerint a kinetikus OG nagyon hasonló az egyensúlyi OG-hoz (citokróm c, apomioglobin)
• Irányított mutagenezissel végzett kísérletek ugyanezt adják

A "hirtelen megugrási" (burst) intermedier

• A felgombolyodás során néhány ms-en belül ("burst", megugrási szakasz) képződik egy intermedier, jelentős másodlagos szerkezettel (a natív 50-100%-a)
• ANS-kötésnek is van ugyanilyen gyors fázisú szakasza
• citokróm c hem csoportjának kioltása egy triptofán által, szintén a burst fázisban, arra utal, hogy a kompaktizálódás is bekövetkezik
• --> a "burst" intermedier is OG jellegű, de inkább a pre-OG-re hasonlít. Pre-OG a burst intermedier egyensúlyi megfelelője?

Vitás kérdések

Natívszerű-e az olvadt gombóc?

• Hagyományos olvadtgombóc-modell (à la Ptitsyn):
  
  
  • Lényegében megvan a lánc natív topológiája, csak az oldalláncok szoros illeszkedése hiányzik
  • A szerkezetnek két szintje van: a lánc nagybani alakja és az oldalláncok pontos illeszkedése a harmadlagos szerkezetben
• Alternatív álláspont: nincs meg a natív topológia
  • Privalov 1997: Nem jó az olvadtgombóc-modell, mert
    • Termodinamikai mérések alapján állítható, hogy ami olvadt gombócnak látszik, az vagy rosszul felgombolyodott (nem natív topológiájú) fehérje, vagy pedig egy része (domén v. szubdomén) felgombolyodott, többi része rendezetlen
    • Ha már megvan az egész natív topológia, akkor az oldalláncoknak nagyon gyorsan össze kéne pakolódni
  • Creighton: a legtöbb olvadt gombócot meglévő natív diszulfidhidak mellett állították elő. Ha ezeket felbontjuk, nemigen alakul ki natív szerkezet
  • Dill: Elméleti modellek alapján: nem lehet, hogy az oldalláncok erősen mozognak, a gerinc meg nem; a kettő szorosan csatolt
  • Újabb cikkek: az aggregátumok könnyen összetéveszthetőek OG állapottal

A Ptitsyn-modell mellett talán több kísérleti bizonyíték szól, de egyre többen hajlanak a Privalov-féle nézetre is. Úgy tűnik, sokféle olvadt gombóc van, nem olyan egyszerű a helyzet, mint korábban gondolták.

A felgombolyodás intermedierjei rajta vannak-e a felgombolyodás útvonalán, vagy kívül esnek rajta?

• A kinetikai kísérletek eredményeit többnyire jól lehet illeszteni az U=I=N (on-pathway) és I=U=N (off-pathway) modellre is
• On-pathway: I nagyobb koncentrációja gyorsítja a felgombolyodást
• Off-pathway: lassítja
• mindkettőre vannak példák

Az olvadt gombócok élettani szerepe

Fehérjetranszport membránon át

• Két szakasz: (1) a fehérje hozzátapad a membránhoz, (2) más fehérjék révén egy ATP-függő mechanizmus átviszi
• Kimutatták: hozzátapadás gyorsabb, ha OG állapotban adjuk a fehérjét
• Hozzátapadt állapotban érzékenyebb a proteázokra
• Számos fehérjénél, pl. mitokondriumba irányuló transzport

Membránba fűződés

• Pl. toxinok, melyek a sejtmembránba ágyazódnak, áteresztővé téve azt. Ilyen a kolicin A:
  
  (a) a kolicin natív szerkezete, (b) a membránba ágyazódott szerkezete (valószínűsíthető)
• A belső két, hidrofób hélix kifordul.
• Kimutatták, hogy a kolicinnak van savas OG állapota, ez indukálódhat a membrán közelében, megkönnyítve az átalakulást. (A membrán felszínén töltések vannak, ezért ennek közelében a citoplazma pH-ja, ionerőssége eltérhet a távolabbi régiók pH-jától.)
• Sok más, hasonló fehérjénél

Kötődés chaperonokhoz

• Chaperonok részlegesen felgombolyodott fehérjét kötnek, számos kísérlet szerint valamiféle OG vagy pre-OG jellegű állapotot.
• Alfa-laktalbumin kötődik a GroEL chaperoninhoz, az OG-nél valamivel kevésbé kompakt állapotban

Egyéb

• Többalegységes fehérjék összeszerelődésénél (monomerek OG-ben lehetnek)
• Apoláros ligandumok szállítása: membrán közelében a fehérje OG-vé válik, és lelöki magáról az apoláros ligandumot
• Receptor-ligandum kapcsolódás: némi mozgékonyság kell hozzá
• Emésztődés a lizoszómában, savas környezetben
• Ubiquitinfüggő folyamatok (pl. degradáció): az ubiquitin (egy 76 aminosavból álló, kis fehérje) kovalens kötődése a fehérjéhez OG állapotba viheti a fehérjét, ezáltal előkészíti lebontásra a proteaszóma (a sejt fehérjelebontó gépezete) számára