A fehérjék szerkezete és az azt meghatározó kölcsönhatások

A fehérjék szerepe az élőlényekben

Fehérjék csoportosítása biológiai feladataik alapján

Fehérjék csoportosítása szerkezetük alapján

• Globuláris fehérjék
• Fibrilláris fehérjék

A fehérjék szerkezetének szintjei

• Elsődleges szerkezet
• Másodlagos szerkezet
  • Topológiák (szupermásodlagos szerkezet)
• Harmadlagos szerkezet
  • Architektúrák
  • Domének
• Negyedleges szerkezet

A fehérjék építőkövei: az aminosavak

Az R oldallánc húszféle lehet:

Az oldalláncok tulajdonságai

• A Gly növeli a főlánc flexibilitását
• Az elágazó oldalláncok merevebbek (Val, Ile, Leu)
• A Pro visszakapcsolódik a főláncba, ezzel merevít
• A Cys diszulfidhidakat képezhet
• A His pK-ja 6,0, lehet töltött vagy töltetlen, gyakran vesz részt a katalízisben

Másodlagos szerkezet

A polipeptidlánc flexibilitása

• A peptidkötés általában merev (részleges kettőskötés rezonancia miatt)
  • cisz és transz állapotok lehetségesek, de a transz állapot sokkal kedvezőbb energetikailag a cisz-nél.
  • Kivéve a prolint, ahol a cisz állapot csak alig kedvezőtlenebb a transz-nál, fehérjékben gyakran elő is fordul.
• Forgás az alfa-szénatom melletti két kötés körül lehetséges (fí, pszí szögek)
• Az atomok kölcsönhatásai, ütközései miatt az egyes (fi,pszi) párokhoz tartozó konformációk nem azonos energiájúak. Ramachandran-térképen (Ala):
  
  
  • Alfa-hélix és béta-redő energiaminimumai
  • A Gly esetében a gerinc sokkal szabadabb, a Pro esetében pszi értéke mindig -60 fok körüli.

Másodlagos szerkezeti elemek

• Másodlagos szerkezet: a lánc gerincének rövid távú szerkezete
• A polipeptidláncot szakaszokra bonthatjuk:
  • Jellegzetes konformációk
    • periodikus konformációk (homokonformációk; ugyanaz a (fi,pszi) pár ismétlődik). Pl. hélixek, béta-redő.
    • aperiodikus konformációk (heterokonformációk; a (fi,pszi) változik a lánc mentén). Pl. béta-kanyarok, gamma-kanyar.
  • Nem-jellegzetes konformációk (szabálytalan szerkezetek)

Hélixek

310 hélix	Alfa-hélix	Pi-hélix
310, menetenként 3 aminosavrész, egy H-kötés 10 atomot fog közre i --> i+3 H-kötések (CO és NH között) túl szoros pakoltság, torzult H-kötések, ezért kedvezőtlen ritka, csak rövid szakaszok fordulnak elő, többnyire alfa-hélixek utolsó fordulataként	3,613, menetenként 3,6 aminosavrész, két H-kötés 13 atomot fog közre i --> i+4 H-kötések (CO és NH között) nagyon stabil, kedvező, ezért igen gyakori fehérjékben 4-30 aminosavrészből áll, átlagosan 11-ből (3 fordulat)	4,416, menetenként 4,4 aminosavrész, két H-kötés 16 atomot fog közre i --> i+5 H-kötések (CO és NH között), de nagy a távolság számos ütközés, a hélix tengelyében lyuk van, ezért kedvezőtlen soha nem figyelték meg
Az oldalláncok kifelé állnak. A peptidcsoportok mind ugyanúgy állnak, ezért a hélixnek makrodipólja van A fentiek mind jobbkezes hélixek. A balkezes energetikailag kedvezőtlen az oldalláncok ütközései miatt, ezért nem fordul elő.

Amfipatikus alfa-hélix

A hélixnek a fehérje belseje felé eső oldalán elsősorban apoláros, a víz felé eső oldalán poláros oldalláncok vannak.

Egyéb hélixek

• Kollagénhélix: három párhuzamosan futó lánc, balkezes hélixként egymásba fonódva.
• Poliprolin hélix
• Poliglicin

Béta-redő

• Parallel vagy antiparallel módon futó szálak, közöttük H-kötések.
• Az oldalláncok váltakozva lefelé és fölfelé állnak
• Igen gyakori a fehérjékben
• A legtöbb béta-lemezben balkezes csavar van, mert az egyes szálak maguk is kissé csavarodnak.
• A béta-lemez méretének nincs határa. A selyemfibroin nagyon hosszú, csavart béta-lemezekből áll.

Kanyarok (turnök)

• Béta-kanyar: olyan, nemhelikális tetrapeptid, amelynél az első és az utolsó alfa-szénatom távolsága 7 angströmnél kisebb.
• Gamma-kanyar: olyan tripeptid, melyben az első és az utolsó peptidcsoport között hidrogénkötés van.
• Számos kanyartípust definiáltak a szögek alapján: 7-féle béta kanyar (+ háromnak a tükörképe is), 2-féle gamma-kanyar

Topológiák

A másodlagos szerkezeti elemek jellegzetes elrendeződései

• A béta-valami-béta motívumok általában jobbkezesek, mert a polipeptidlánc gerince jobbfelé szívesebben csavarodik.
• 2 hélixből álló motívum a "coiled coil" (csavart csavar): két hosszú hélix egymás köré csavarodva. Pl. keratin, tropomiozin.
  

Harmadlagos szerkezet

A teljes polipeptidlánc térbeli szerkezete, a másodlagos szerkezeti elemek térbeli elrendeződése

Architektúrák: jellegzetes harmadlagos szerkezetek. Pl.:

Hélixköteg (citokróm C)	Hélixek (hemoglobin)
Egyszeres redő (heregulin alfa)	Béta hordó (porin)
Béta szendvics (hisztokomp. antigén)	Béta hasáb (agglutinin)
Béta propeller (metilamin dehidrogenáz)	Béta szolenoid (Fágfeherje)
Alfa-Béta tekercs (scytalone dehidratáz)	Alfa-Béta hordó (triózfoszfát izomeráz)
Alfa-Beta 2-szendvics (barnáz)	Alfa-Béta 3-szendvics (génszabályozó fehérje)
Alfa-Béta 4-szendvics (DNáz)	Alfa-Béta Lópatkó (RNáz inhibitor)

Domének

• A polipeptidlánc globuláris régiói
• Feltehetően a felgombolyodás egységei
• A nagyobb fehérjék mind 100-150 aminosavnyi doménekre oszlanak
• Az egyes doméneknek gyakran más-más funkciója van

Foszfoglicerát kináz két doménje

Fold ("gomboly")

A gomboly (angolul fold) egy fehérjedomén globális, nagy vonalakban vett szerkezete. Lényegében a polipeptidlánc gerincének hozzávetőleges térbeli lefutását értjük alatta. Magában foglalja tehát a másodlagos szerkezeti elemek egymáshoz viszonyított körülbelüli térbeli elhelyezkedését, és az összeköttetéseik sorrendjét, a topológiát.

Az egymáshoz nagyjából hasonló térszerkezetű fehérjéknek tehát ugyanolyan a "gombolyuk". Az azonos gombolyt mutató fehérjék egy szerkezeti családba tartoznak.

Negyedleges szerkezet

A több polipeptidláncból álló fehérjék alegységszerkezete

Gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

Koenzimek, prosztetikus csoportok

• Nem fehérje természetű molekulák, melyek a fehérjéhez kapcsolódnak
• Koenzim: könnyen disszociál
• Prosztetikus csoport: erősen kötődik a fehérjéhez

Mioglobin, benne hem csoporttal

Mag és felszín

• A fehérje belsejében az oldalláncok szorosan illeszkednek
• A térkitöltés sűrűsége: átlagosan 0,75 (mint egy jó kristály)
• A belső magban eltemetett oldalláncok többségében hidrofóbok, a felszínen lévők polárosak vagy töltöttek
• A hidrofób oldalláncok 63%-a belül van, a maradék hidrogénkötött poláros oldallánc.
• A töltött oldalláncok a felszín 27%-át teszik ki.
• Előfordulnak belső üregek, ha elég nagyok, víz is lehet bennük, hidrogénkötötten.

A fehérjék konformációs stabilitásáért felelős kölcsönhatások

• Rövid távú taszítás
• Van der Waals kölcsönhatás
• Elektrosztatikus kölcsönhatás
• Hidrogénkötés
• Hidrofób kölcsönhatás
• Diszulfidhidak
• Kooperativitás

Rövid távú taszítás

• Az elektronpályák taszítása miatt
• A távolság csökkenésével rohamosan nő az energia (szokás 1/r¹²-es függvénnyel közelíteni)
• Jó közelítéssel meghatározott sugarú, kemény gömböknek tekinthetjük az atomokat. Sugaruk a Van der Waals-sugár.

Van der Waals-kölcsönhatás

• más néven London-erők vagy diszperziós erők
• bármely két atom között hatnak, az indukált dipólmomentumok kölcsönhatása miatt
• távolságfüggése 1/r⁶-os
  
  
• A rövid távú taszítással összevonva adódik a Lennard-Jones potenciál:
  E = A/r¹² - B/r⁶
  

Elektrosztatikus kölcsönhatás

A Coulomb-kölcsönhatás szerint:

• A relatív dielektromos állandó a fehérje belsejében kb. 4, a vízben kb. 80 (erős árnyékolás).
• Sóhidak (ionpárok): Lys, Arg és Glu, Asp között
• A peptidkötés dipólmomentumát hélix felerősíti
• A láncvégeken töltött amino-, ill. karboxilcsoportok

Vizes oldatban:

• A töltések körül nagyméretű hidrátburok van. Ha két ellentétes előjelű töltést közel akarunk vinni egymáshoz, hogy kialakuljon a Coulomb-kölcsönhatás, ahhoz előbb le kell választani róluk a hidrátburkot (deszolvatáció), ami igen energiaigényes.
• A két töltés kölcsönhatásba lépésekor kedvező Coulomb-kölcsönhatás jön létre, és egy kisebb hidrátburok. Ez az energianyereség nem fedezi a hidrátburkok lefejtéséhez felhasznált energiát.
• Vizes oldatban tehát az elektrosztatikus kölcsönhatás energiája általában kedvezőtlen!
• Fehérjében: Gyakran destabilizál (nem a stabilitásban, hanem a szerkezet specificitásában van szerepe), de stabilizálhat, ha egyéb kölcsönhatások "rásegítenek", ill. ha az ionpárok hálózatot képeznek.
• Magas hőmérsékleten: a hidrátburok jóval vékonyabb, lazább. A deszolvatáció "olcsóbb" (kevésbé energiaigényes). A kölcsönhatás energiája kedvező lehet. Termofil fehérjéknél gyakori.

Hidrogénkötések

• Nagy elektronegativitású atomhoz kapcsolódó hidrogének létesítik, nagyrészt elektrosztatikus kölcsönhatás
• Típusai a fehérjékben:
  

  Donor-akceptor	Séma
  Hidroxil-hidroxil	-O-H...OH
  hidroxil-karbonil	-O-H...O=C<
  amid-karbonil	>N-H...O=C<
  amid-hidroxil	>N-H...OH
  amid - imidazol	>N-H...N<
  amid-kén	>N-H...S<

• Bifurkáció lehetséges (egyazon akceptor két donorhoz is köt)
• A proton az akceptort és a donort összekötö vonalon helyezkedik el, de a két dipólus gyakran nem esik egy vonalba, így csökkent az energia.

Hidrofób kölcsönhatás

• Hidrofób molekulát szobahőmérsékleten apoláros folyadékból vízbe viszünk át. Ekkor
  • A víz kb. ugyanolyan energiájú kölcsönhatásokat létesít a hidratáció során, mint az apoláros folyadékban a molekulák egymás közti VdW kölcsönhatásai --> entalpiaváltozás kb. 0.
  • A víz az apoláros molekula körül (mivel nem tud H-kötést képezni vele) nagymértékben rendeződik, ketrec-szerű hidrogénkötött szerkezetbe. Emiatt jelentős entrópiacsökkenés van.
  • Ebből adódóan az átvitel szabadentalpiája nagy, tehát kedvezőtlen.
  • A hőmérsékletet emelve az apoláros molekula körül rendeződött vizet ki kell "olvasztani". Emiatt a hőkapacitás nagy.
• Az átvitelkor az entrópiacsökkenés arányos az apoláros molekula felszínével.
• Az apoláros molekulák aggregálódásakor az apoláros felszín csökken, a ketrec-szerű szerkezetbe rendeződött vízmolekulák nagy része felszabadulhat, ami entrópianövekedéssel jár, ezért a folyamat kedvező. Ez a hidrofób kölcsönhatás.
• Mivel az aggregáció entrópianövekedéssel jár, a hőmérséklet növelése kedvez neki. A hőmérséklet növelésével a hidrofób kölcsönhatás eleinte erősödik (szabadentalpiában mérve).
• A kölcsönhatás hőmérsékletfüggése bonyolult: A hőmérséklet emelésével az entrópianyereség csökken (kb. 125 Celsius-fokon 0 lesz), az entalpikus járulék (itt nem részletezendő okok miatt) viszont nő. Ezért magas hőmérsékleten már csökken a hidrofób kölcsönhatás erőssége. A kölcsönhatás maximuma kb. 75 Celsius-foknál lehet.
  
  DeltaG_HPH: szabadentalpia, a hidrofób kölcsönhatás erősségét jellemzi
• Hidrofobicitási skálák: sokféle definíció a többféle mérési módszer alapján
• Aminosav-oldalláncok hidrofobicitása: arányos az apoláros felszínük nagyságával

Diszulfidhidak

• Magára a felgombolyodott szerkezetre kevés hatása van
• Szerepe az, hogy a szétgombolyodott polipeptidlánc mozgásszabadságát, konformációs entrópiáját csökkenti, ezáltal a legombolyodás kedvezőtlenebb lesz.
• A konformációs entrópiára gyakorolt hatása becsülhető:
  delta S_konf = -b-(3/2)R ln n

  ahol n a két ciszteint elválasztó aminosavrészek száma, b egy konstans (értéke nehezen becsülhető)

• Tehát minél távolabbi részei vannak összekapcsolva a láncnak, annál nagyobb a stabilizáló hatás.

Kooperativitás

• A fehérjemolekula konformációját eléggé gyenge kölcsönhatások stabilizálják, de igen sok van belőlük
• A kölcsönhatások között kooperáció áll fenn: erősítik egymást, ezért együttes hatásuk nagyobb, mint a külön-külön vett hatásaik összege.
• A konformációs stabilitás nagy számú stabilizáló és destabilizáló hatás eredőjeként áll elő (nagy számok kis különbsége).

Fehérjeadatbázisok

• PDB: Protein Data Bank
  • Az ismert térszerkezetek adatbázisa
  • Mintegy 13 000 szerkezet (de ezek között csak kb. 1000 lényegesen különböző). (Becslések szerint kb. 10 000 lényegesen különböző fehérjeszerkezet létezhet az élővilágban.)
• SWISS-PROT
  • Az ismert fehérjeszekvenciák adatbázisa
  • Mintegy 90 000 szekvencia, és részletes leírások a fehérjékről.
• Egyéb: számos más adatbázis, pl. fehérjecsaládok, domének, negyedleges szerkezetek, fehérjék génjei, szekvencia-összerendezések, szerkezetek minőségellenőrzéseinek eredményei, termodinamikai paraméterek, stb.

Szerkezeti családok

A fehérjék térszerkezetük alapján családokba sorolhatóak.

• SCOP és CATH adatbázisok
• Hierarchikus felépítésűek
• SCOP hierarchia teteje: osztályok:
  1. Tisztán alfa fehérjék
  2. Tisztán béta
  3. Alfa és béta (a/b) (parallel béta, váltakozó alfa és béta régiók)
  4. Alfa és béta (a+b) (antiparallel béta, elkülönülő alfa és béta régiók)
  5. Többdoménes fehérjék (domének más-más osztályban)
  6. Membrán- és sejtfelszíni fehérjék és peptidek
  7. Kis fehérjék (nagy része ligandum vagy prosztetikus csoport)
  8. "Coiled coil" fehérjék
  9. Kisfelbontású fehérjék
  10. Peptidek
  11. Tervezett fehérjék
• CATH:
  
  "CATH-kerék": a CATH adatbázisban lévô szerkezetek megoszlása a főbb osztályok szerint
  
  • Színek: piros: alfa, zöld: béta, sárga: alfa/béta, kék: nincs másodl. szerk.
  • Belső kerék: architektúrák
  • Külső kerék: topológiák
• A SCOP hierarchia további szintjei:
  • Család: egyértelmű evolúciós rokonság
    A szekvenciaazonosság a család tagjai között 30% vagy nagyobb, vagy pedig a hasonló funkcióból és szerkezetből egyértelmű az evolúciós rokonság (akár 15% szekvenciaazonosság mellett is)
  • Főcsalád (superfamily): Valószínűsíthető közös evolúciós eredet
    Alacsony szekvenciaazonosság, de a funkcionális és szerkezeti hasonlóságok közös evolúciós eredetre utalnak
  • Fold ("gomboly"): Jelentős szerkezeti hasonlóság
    Lényegében ugyanolyan másodlagos szerkezeti elemek, ugyanolyan sorrendben, ugyanolyan topológiával. A perifériális részek jelentősen eltérhetnek. Nem feltétlenül közös eredet magyarázza a hasonló szerkezetet.

A szerkezet sokkal konzerváltabb, mint a szekvencia

• 30%-os szekvenciaazonosság a legtöbb esetben nagymértékű szerkezeti hasonlóságra utal
• 10% alatti szekvenciaazonosság esetén is lehet lényegi hasonlóság két szerkezet között
• 20-30% közötti szekvenciaazonosság: alkonyzóna. Lehet, hogy hasonlítanak a szerkezetek, de lehet, hogy nem. Nehezen kezelhető.

A fehérjék szerkezetének meghatározása

A triózfoszfát izomeráz térszerkezete

A térszerkezet meghatározásának módszerei

• Röntgendiffrakció: kristályos állapotból, tetszőlegesen nagy méretű fehérjékre. A hidrogéneket nem mutatja.
• NMR (mágneses magrezonancia): oldatban, csak kisméretű fehérjékre.
• Neutrondiffrakció (még nem elterjedt, de ígéretes)