A felgombolyodás problémája

A felgombolyodási probléma

(genetikai kód második fele)

Anfinsen kísérlete (1961)

• Ribonukleáz enzim, benne 8 cisztein, 4 diszulfidhíd
• Diszulfidhidakat béta-merkapto-etanollal redukáljuk és a fehérjét 8M ureával denaturáljuk --> rendezetlen szerkezet, hiányzó aktivitás
• Levegőn állni hagyjuk --> lassú oxidáció --> néhány óra alatt a szerkezet helyreáll, az enzim aktívvá válik
• Oxidálószerrel gyors oxidáció --> diszulfidhidak rossz párosításban állnak helyre --> sem a szerkezet, sem az aktivitás nem áll helyre
• Ez a hibás szerkezet kevés redukálószer hozzáadására kijavítódik

Következtetés: az aminosavsorrend tartalmazza a háromdimenziós szerkezet kialakulásához szükséges összes információt. A felgombolyodás termodinamikai kontroll alatt áll: a natív szerkezet a termodinamikailag legstabilisabb állapot.

Tehát: az elsődleges szerkezet meghatározza a 3D szerkezetet. De

Ez a felgombolyodási probléma.

Alproblémák:

• Milyen kinetikus folyamat vagy útvonal révén veszi fel a fehérje a natív, biológiailag aktív konformációt?
• Mi a felgombolyodott konformációk stabilitásának fizikai alapja?
• Az aminosavsorrend miért éppen azt a 3D szerkezetet és felgombolyodási mechanizmust határozza meg, amit, és miért nem valami mást?
• Ha adott egy fehérje aminosavsorrendje, hogyan lehet abból a háromdimenziós szerkezetet megjósolni?

Az első kérdés részkérdései:

• A felgombolyodás termodinamikai vagy kinetikai kontroll alatt áll? Hogyan képes a polipeptidlánc rövid idő alatt megtalálni a natív szerkezetet?
• Mi indítja el a felgombolyodást, és mi az ehhez szükséges legrövidebb idő?
• Milyen útvonalon történik a felgombolyodás? Milyen a köztitermékek szerkezete?
• Az in vitro kísérletek alapján felismert szabályszerűségek érvényesek-e in vivo is?

A felgombolyodási probléma jelentősége

• Elméleti jelentőség: A molekuláris biológia és a fehérjebiofizika egyik legizgalmasabb, legtöbb fejtörést okozó problémája. Számos sejtbiológiai folyamattal nagyon szorosan összefügg.
  • A genetikai kód második fele
  • A fehérjék bioszintézise és degradációja
  • Hősokk
• Biotechnológiai jelentőség:
  • A baktériumban túlexpresszióval termeltetett idegen fehérjék legtöbbször ún. inklúziós testekké tapadnak össze. Ezekből kell a fehérjéket renaturálni.
• Orvosi jelentőség: "felgombolyodási betegségek": Mutáció hatására vagy nem megfelelő körülmények között egyes fehérjék rosszul gombolyodnak fel, aggregálódnak.
  • Prionbetegségek: Amiloid lerakódások keletkezése szivacsos agysorvadásban (kergemarhakór, Creutzfeld-Jakob)
  • Amiloid rostok Alzheimer-kórban

A Levinthal-paradoxon: termodinamikai vagy kinetikai kontroll?

• Anfinsen kísérlete --> a natív térszerkezet a polipeptidlánc szabadentalpia-minimumának felel meg, azaz termodinamikailag az a legstabilabb állapot az adott körülmények között. Tehát a felgombolyodás termodinamikai kontroll alatt áll.
• Hogyan találja meg a lánc az energiaminimumot?
  
  • Minden peptidegységnek kb. 10 különböző konformációja van
  • Tehát egy 100 aminosavból álló láncnak 10¹⁰⁰ különböző konformációja van.
  • Egyik aminosavkonformáció a másikba legalább 10^-13 másodperc alatt alakul át, a teljes láncra vonatkoztatva 10^-11 mp alatt.
  • Tehát a natív konformáció megtalálásához kb. 10⁸⁹ másodpercre, azaz kb. 10⁸¹ évre van szükség.
  • A valóságban 1 másodpercen belül felgombolyodik.
• A gyors felgombolyodás csak úgy lehetséges, ha a konformációs tér nem férhető hozzá teljes egészében a lánc számára, hanem a folyamat egy útvonalon halad, kinetikai kontroll alatt áll.
• Ez a Levinthal-paradoxon (Levinthal 1968): az Anfinsen-kísérlet szerint termodinamikai kontroll van, az állapotszámlálás szerint kinetikai kontroll. Most akkor melyik?
• A paradoxon feloldása: lásd később.

A fehérjék stabil konformációs állapotai

• A legombolyodott (denaturált) állapot. Jele: U (unfolded) vagy D (denatured)
• A felgombolyodott (natív, általában biológiailag aktív) állapot. Jele: F (folded) vagy N (natív).
• A köztes állapotok (köztitermékek, intermedierek). Jelük: I (intermediate)

A legombolyodott (denaturált) állapot

• Ideális esetben: véletlen elrendeződésű lánc (random coil)
  • minden torziós szög független a szekvenciában távolabbi torziós szögektől
  • minden konformációnak kb. azonos a szabadentalpiája
  • kivéve, ahol a lánc átfedné önmagát (kizárttérfogat-effektus)
  • 100 aminosav --> 10¹⁰⁰ konformáció. Ha egy oldatban 10 mg fehérje van, ez kb. 10¹⁸ db molekula. Tehát: várhatóan mindegyik molekula más-más konformációban van.
  • Erős denaturálószerekben (6M GdmHCl, 8M urea) a fehérjék jó közelítéssel valóban véletlen elrendeződésűek (hidrodinamikai tul. szerint)
• Enyhébb denaturálószerek, ill. pH- vagy hőmérsékleti szélsőségek: a szerkezet kevésbé random, s valamivel kompaktabb.
  • Lokális hidrofób oldallánc-csoportosulások
  • egy kevés hélixtartalom (főleg alkoholos oldatban)
• Termodinamikailag a legombolyodott állapot egységes: nem tartalmazhat kooperatívan felgombolyodott részstruktúrákat.

A teljesen felgombolyodott, natív állapot

• Alapegység a domén
  • Számos esetben kimutatták, hogy az izolált domének önállóan képesek felgombolyodni.
  • Azonban az izolált domének többnyire nem olyan stabilak, mint a teljes fehérje (pl. foszfoglicerát kináz)
  • Az izolált doménekből általában nem rakódik össze a funkcióképes fehérje
• Szubdomének (doménnél kisebb töredékek): egyes esetekben szintén képesek önálló felgombolyodásra, más esetekben nem.
• Doménméret felső határa kb. 200 aminosav. Ennél nagyobb feltehetően nem gombolyodna fel.
• A szerkezet állandósága:
  • A különböző kristályformákból röntgendiffrakcióval és az oldatból NMR-rel nyert 3D szerkezetek lényegében mindig azonosak
  • A szerkezet kisebb-nagyobb mértékben flexibilis (Brown-mozgás, kis fehérjék néhány óránként vagy naponként teljesen le is gombolyodnak), de közel marad az átlagszerkezethez.

A köztes állapotok

Másképpen: kompakt denaturált állapotok. Csak akkor figyelhetők meg, ha elég sok molekula veszi fel ezeket, tehát ha eléggé stabilak.

• Híg denaturálószerben vagy szerves oldószerben
• A leginkább vizsgált: "olvadt gombóc" (molten globule) állapot
  • kompakt
  • nagy konformációs fluktuációk, különösen az oldalláncoknál
  • laza, nemspecifikus hidrofób kölcsönhatások
  • rendezetlen, fluktuáló harmadlagos szerkezet
  • ellenben a natívhoz hasonló másodlagos szerkezet
  • számos fehérjében kimutatták (pl. alfa-laktalbumin, mioglobin)
• "Pre-olvadt-gombóc" (pre-molten-globule):
  • kevésbé kompakt, sokkal lazább
  • van másodlagos szerkezet, de nem mindig hasonlít a natívhoz
  • néhány fehérjénél kimutatták (citokróm c, triptofán szintáz)
• "Nagy rendezettségű" olvadt gombóc:
  • a natív harmadlagos szerkezet egy része megvan
  • kevésbé fluktuál
  • néhány fehérjénél találták (ubiquitin, antitest)
• Vitatott, hogy a köztes állapotok rajta vannak-e a felgombolyodás útvonalán, vagy "útelágazások" eredményei.

A felgombolyodás általános tulajdonságai

• A natív állapot többnyire reverzibilisen legombolyítható:
  • denaturálószer hozzáadásával
  • melegítéssel vagy hűtéssel
  • pH változtatásával (savanyítás, lúgosítás)
  • nagy nyomással
  • a diszulfidkötések elhasításával
• Kicsi, egydoménes fehérjék esetében többnyire:
  

  kétállapotú átmenet (N natív, D denaturált áll.)
  A köztes állapotok ezeknél nem figyelhetőek meg. Kooperativitás érvényesül: egy molekula vagy az N, vagy a D állapotban marad csak meg tartósan, minden egyéb állapotból vagy az egyikbe, vagy a másikba ugrik.

• Más fehérjéknél köztes állapotok is fellépnek
• A populációk eloszlása a felgombolyodottság mértékének függvényében:
  

  Bal oldal: egy kétállapotú, kooperatív átmenetet mutató fehérje populációeloszlásai (kicsi, egydoménes fehérjékre jellemző)
  Jobb oldal: köztes állapottal rendelkező, nemkooperatív úton legombolyodó, hipotetikus fehérje populációeloszlásai

A felgombolyodott állapot stabilitása

Mennyiségek és értelmezésük

• Állandó nyomás és hőmérséklet: a rendszer egyensúlyi állapotát a szabadentalpia (G) minimuma adja.
  
• Kedvező és ezért spontán módon végbemegy az a folyamat, melynek során G csökken. Kedvezőtlen, ezért spontán módon nem megy végbe az a folyamat, melynek során G növekedne.

  A folyamat jellege	G változása	H változása	S változása	Értelmezés
  Kedvező	-	-	kicsi	Kölcsönhatások jönnek létre, melyek csökkentik a belső energiát, ezáltal a szabadentalpiát
  	-	kicsi	+	A rendszer mozgásszabadsága nő, így növekszik az entrópia és ezzel a szabadentalpia
  Kedvezőtlen	+	+	kicsi	Kölcsönhatások szakadnak fel, melyek növelik a belső energiát, ezáltal a szabadentalpiát
  	+	kicsi	-	A rendszer mozgásszabadsága csökken, így csökken az entrópia és ezzel a szabadentalpia

• Az entrópia és az entalpia általában egyirányba változik:
  • Ha kölcsönhatások jönnek létre, az entalpia csökken, s a mozgásszabadság csökken, így az entrópia is csökken
  • Ha kölcsönhatások szakadnak fel, az entalpia nő, s a mozgásszabadság nő, így az entrópia is nő
• Mi dönti el, hogy az entalpiacsökkentő vagy az entrópianövelő folyamat valósul-e meg? A hőmérséklet, amely a szabadentalpia kifejezésében az entrópiát súlyozza.

  Hőmérséklet	Kedvező folyamat	Hová törekszik a rendszer?
  Alacsony	Entalpiacsökkenés: kölcsönhatások kialakulása (emiatt valószínűleg a mozgásszabadság csökkenése: entrópiacsökkenés)	Az alacsony entalpiájú állapotok felé (melyekben a mozgásszabadság valószínűleg korlátozott, az entrópia alacsony)
  Magas	Entrópianövekedés: a mozgásszabadság növekedése (emiatt valószínűleg kölcsönhatások felbomlása: entalpianövekedés)	A magas entrópiájú állapotok felé (melyekben a kölcsönhatások valószínűleg felbomlanak, az entalpia magas)

  
  

• Példa: két állapottal rendelkező rendszer esetében:
  • 1. állapot: alacsony entalpia, alacsony entrópia (pl. fehérje natív állapota: sok kölcsönhatás, kicsi mozgásszabadság)
  • 2. állapot: magas entalpia, magas entrópia (pl. fehérje denaturált állapota: kevés kölcsönhatás, nagy mozgásszabadság [a lánc mozgásszabadságát a konformációs entrópia jellemzi)
  
• A valóságban a helyzet bonyolultabb, mert denaturált állapotban az apoláros oldalláncok körül a víz rendezett, alacsony entrópiájú, a felgombolyodásnál ezek a vízmolekulák felszabadulnak, ami entrópianövekedéssel jár. A konformációs entrópia csökkenése azonban jelentősebb ennél.

A fehérjék termodinamikai paramétereinek hőmérsékletfüggése

A lizozim termodinamikai paraméterei:

• A natív és a denaturált állapot közötti entalpia- és entrópiakülönbség erősen hőmérsékletfüggő, mert a két állapot hőkapacitása erősen eltér (a denaturálté sokkal nagyobb a nagyobb hidrofób felszín miatt)
• A natív állapot stabilitásának mértéke a natív és a denaturált állapot közötti szabadentalpia-különbség (deltaG).
• deltaG egy parabolaszerű görbe, amely két helyen metszi a vízszintes tengelyt:
  
• deltaG-nek közepes hőmérsékleten van egy szélsőértéke. Itt maximális a stabilitás
• Az egyik metszéspont a hődenaturáció hőmérséklete (olvadáspont, T_m)
• A másik metszéspont a hidegdenaturáció hőmérséklete (gyakran 0 Celsius alá esik)
• deltaG 5-15 kcal/mol (20-60 kJ/mol) közé esik, tehát a fehérjék stabilitása kicsi. (Nagy számok kis különbsége)
• az N és U állapotok közötti egyensúlyi állandó 10⁴-10⁷ körüli.

A felgombolyodás kooperativitása

Mi az oka a kétállapotú átmenet kooperativitásának?

• A részlegesen felgombolyodott állapotokban olyan kedvezőtlen kölcsönhatások lehetnek, amelyek sem a natív, sem a denaturált állapotban nincsenek meg
• Az egyes kölcsönhatások kooperativitása
  

  Két kölcsönhatás. Mindkettő erősíti a másikat egy lambda kooperativitási faktorral. Ok: közelebb hozza a kölcsönható partnereket, így kisebb lesz az entrópiaköltség.

  Több kölcsönhatás esetén: Példa:

  
  • 10 kölcsönhatás van, a legombolyodott állapotban mindegyikre K=10^-4
  • A kooperativitás lambda=10 együtthatóval érvényesül
  • Emiatt ha n kölcsönhatás már megvan, akkor az n+1. K*lambdaⁿ egyensúlyi állandóval jön létre (felső grafikon)
  • Alsó grafikon: A legombolyodott állapot és az n kölcsönhatást tartalmazó állapot közötti egyensúlyi állandó. Eleinte csökken, majd nőni kezd. 10 kölcsönhatásnál az állapot stabilizálódik.
  • Tehát sok gyenge kölcsönhatás a kooperativitás miatt stabilizálja egymást.

A felgombolyodás modelljei

• "Nukleáció és gyors növekedés" (Wetlaufer 1973)
  A sebességmeghatározó lépés egy "folding mag" keletkezése. Ha ez megvan, a felgombolyodás már erre építkezve gyorsan végbemegy. (Téves.)
  Kinetikai séma:
  
• "Puzzle játék" (jigsaw puzzle, Harrison és Durbin 1985)
  Mivel a denaturált állapotban minden molekula konformációja más, mindegyik más útvonalon gombolyodik fel. Ahogyan egy puzzle-t is sokféle sorrendben lehet összerakni.
  Kinetikai séma:
  
• "Diffúzió-kollízió-adhézió" (Karplus és Weaver 1976)
  A legombolyodott fehérjében időnként natívszerű mikrodomének (pl. hélixrészlet) jelennek meg, miközben a lánc részei diffúziós mozgást végeznek. Ha a mikrodomének összetalálkoznak, összetapadnak és stabilizálják egymást.
• Hierarchikus modellek:
  Felgombolyodás a szerkezeti hierarchia szerint. Mag, másodlagos szerkezet, szupermásodlagos, domén, monomer, oligomer.
• Moduláris modellek
  Szubdomének mint modulok önállóan felgombolyodnak, majd asszociálódnak
• "Keretmodell" (framework model, Baldwin 1989)
  A másodlagos szerkezeti elemek korán létrejönnek (ez a felgombolyodás első lépése) és meglehetősen stabilak. Később jön létre a harmadlagos szerkezet. (Ez egy hierarchikus modell.)
  
• "Hidrofób kollapszus" (Dill 1985)
  Az első lépés a lánc összeesése a hidrofób kölcsönhatás miatt. A másodlagos szerkezet csak ezután vagy ezzel egyidőben jön létre.
  
• "Hidrofób cipzár" (Dill 1993)
  A hidrofób kölcsönhatás cipzárszerű viselkedése segíti a másodlagos szerkezeti elemek létrejöttét.

A felgombolyodás nyomon követésének technikái

Általánosan: a fehérjét denaturáló közegből gyorsan olyan környezetbe visszük, amely a natív állapotnak kedvez. Pl.

• nemdenaturáló pufferrel kihigítjuk
• hidegdenaturált fehérjét hirtelen fölmelegítünk (T-ugrás)
• fotokémiai reakcióval indítunk

Ezután a felgombolyodás folyamatát követjük.

A felgombolyodás beindításának módszerei

• Keveréses módszerek
  • Stopped-flow módszer (enzimkinetikából ismert)
    
    Itt a két hengerben nem szubsztrát és enzim, hanem fehérje és nemdenaturáló puffer van. A dugattyúkat benyomjuk -->: gyors összekeveredés. A megállító dugattyú ütközése állítja meg az áramlást és indítja el a mérést.
    Holtidő: kb. 1 ms.
  • Turbulens keverők
    Pl. Berger-féle golyós keverő.
    Holtidő: >100 mikrosec vagy több
  • Folyamatos áramlású rendszerek. Holtidő: pár 10 mikrosec.
  • "freejet" (szabad sugaras) módszer: lamináris áramlás kis nyíláson. Holtidő: pár 10 mikrosec.
• Nem keveréses módszerek
  • Flash fotolízis: fotoreakció lézervillanással
  • Fényindukált elektrontranszfer (redoxfehérjénél oxidált denaturált állapotban elektrontranszfer felgombolyodást indít)
    Holtidő: < 1 mikrosec
  • T-ugrás, gyors fűtéssel
    elektromos kisüléssel: holtidő 10 mikrosec
    lézerrel: 20 nanosec!!!

A felgombolyodás követésének módszerei

Tulajdonság	Módszer	Felbontás	Mit mér?
A hidrofób mag szorossága	Belső fluoreszcencia	<1 ms	Főleg a triptofánok orientációja és környezete
	Ultraibolya elnyelés	ms	Főleg a tirozinok orientációja és környezete
	Külső (ANS) fluoreszcencia	ms	Hidrofób foltok és árkok képződése, felbomlása
	Fluoreszcencia quenching	ms	A triptofánok elszigeteltsége külső, hidrofil quencherektől
	Ciszteinil quenching	10 s	A ciszteinek védettsége hidrofil reagensektől
A molekula mérete	Fluoreszcencia anizotrópiája	ms	A triptofánok mozgékonysága és kb. molekulaméret
	Fluoreszcenciás energiatranszfer	ms	Triptofán és egy kovalensen kapcsolt fluorofór távolsága
	Kisszögű röntgenszórás	<100 ms	Átlagos girációs sugár
	Kvázielasztikus fényszórás	1 s	Átlagos girációs sugár
Másodlagos szerkezet és tartós H-kötések	Cirkuláris dikroizmus távoli UV-ben	ms	Szekvenciára és populációra átlagolt gerinckonformáció
	"Pulse-labelling" NMR	5-10 ms	Hol vannak stabil amid és triptofán H-kötések
	"Pulse-labelling" tömegspektroszkópia	5-10 ms	Hidrogénkötések képződése diszkrét intermedierekben. Heterogén populációt felbontja!
Harmadlagos szerkezeti kontaktusok, natív szerkezet megléte	Biológiai aktivitás	ms-s	Natív szerkezet az aktív helyen
	Megszakított felgombolyodás	10 ms	Diszkrét intermedierek legombolyodási sebessége (mint stabilitásuk mértéke)
	CIrkuláris dikroizmus közeli UV-ben	ms	Stabil kontaktusok aromás csoportok között, diszulfidhidak
	Valós idejű NMR	1 s	Specifikus kontaktusok oldalláncok között
	Mutációs vizsgálatok		Az egyes oldalláncok energiajáruléka a diszkrét intermedierek stabilitásához

Az átmeneti állapotok jellemzése

• Átmeneti állapot: nagy energiájú, igen rövid élettartamú (ne keverjük össze a köztes állapottal), állapot, két stabil állapot közötti energiagát teteje.
• Jellemzése csak közvetett módszerekkel lehetséges:
  Különféle tényezők hatását vizsgáljuk a felgombolyodás sebességére, ebből az átmeneti állapot tulajdonságaira következtethetünk. Pl.:
  • Hőmérséklet --> termodinamika, aktiválási energia
  • Nyomás --> relatív moláris térfogat
  • denaturálószerek --> vízzel érintkező felszínek
  • ionerősség, pH --> ionizálható csoportok járulékai
• Ezekből általános kép: az átmeneti állapot kompakt, de laza konformációk halmaza

A felgombolyodás kinetikai jellemzői

• Két állapot esetén a felgombolyodás "reakcióegyenlete":

k_f a felgombolyodás, k_u a legombolyodás sebességi állandója. A sebességi állandók kapcsolata az aktiválási energiákkal: k_f=A_fe^-E_a,f/RT, k_u=A_ue^-E_a,u/RT. Az egyensúlyi állandó: K_eq=k_f/k_u

A sebességi és egyensúlyi állandók tipikus hőmérsékletfüggése (Arrhenius-ábrázolás és Van't Hoff-ábrázolás)

• Az ln K ábrázolva 1/T függvényében: Van't Hoff-ábrázolás. Meredekségéből a reakció entalpiája (deltaH) számítható ki.
• Az ln k ábrázolva 1/T függvényében: Arrhenius-ábrázolás. Meredekségéből a reakció aktiválási energiája számítható ki.
• A K_eq Van't Hoff-ábrázolása kismértékben görbült, ez deltaH hőmérsékletfüggéséből ered, ez pedig a natív és denaturált állapot közötti hőkapacitás-különbségből. Utóbbi abból adódik, hogy a felgombolyodás során hidrofób felszínek temetődnek el. (A hőkapacitás ugyanis arányos a szabadon lévő hidrofób felszínek összfelületével.)
• k_f és k_u Arrhenius-ábrázolásából az átmeneti állapot milyenségére lehet következtetni:
  • k_unfolding (=k_u) Arrhenius-ábrázolása lineáris --> a legombolyodás aktiválási energiája hőmérsékletfüggetlen, tehát az átmeneti állapot hőkapacitása megegyezik a natívéval. Ez azt jelenti, hogy az átmeneti állapotban ugyanakkora hidrofób felszín van szabadon, mint a natív állapotban.
  • k_refolding (=k_f) Arrhenius-ábrázolása erősen görbült --> a felgombolyodás aktiválási energiája hőmérsékletfüggő, tehát az átmeneti állapot hőkapacitása eltér a denaturáltétól. Ez azt jelenti, hogy a denaturált állapotból az átmeneti állapotba kerülés során hidrofób felszínek temetődnek el.
  • Konklúzió: az átmeneti állapot sokkal inkább a natív állapothoz hasonlít, mint a denaturálthoz.
• (Csak véletlen, hogy a három görbe egy pontban metszi egymást)

Kinetikai modellek

• A legombolyodás kinetikája ált. egyszerű: két állapot, egy sima sebességi állandó
• A felgombolyodás kinetikája ált. bonyolult
  • néhány kis fehérje esetében itt is jó a kétállapot-modell
  • de általában több kinetikai fázis:
    

    A nemnatív állapotok heterogén populációt alkotnak

A felgombolyodás realisztikusabb sémája

(a) legombolyodott molekulák
(b) hidrofób kollapszus, megjelenő másodlagos szerkezeti elemek, nukleációs helyek
(g) a végcél: a natív fehérje, jobbkezes hélixköteg
(f) rossz konnektivitású konformáció
(d) rossz topológia: balkezes elrendeződés (hibás)
(e) megfelelő elrendeződésű, de még laza állapot
(c) a nem megfelelő köztitermék újból legombolyodhat
(c') vagy átrendeződhet.

Tölcsér: a folyamat során egyre csökken a hozzáférhető állapotok száma (entrópia)

Az "új szemlélet"

• A kismolekuláknál megszokott reakciókinetika fogalmai nehézkesen alkalmazhatóak a felgombolyodásra.
• Heterogén populációk vannak
• Nincs egyértelmű reakciókoordináta

Az új szemlélet kulcsfogalma: energiafelület

Felgombolyodási tölcsér

• Szabadentalpia-felület
• Függőleges tengely: a molekula ún. belső szabadentalpiája. (az adott konformációhoz tartozó szabadentalpia, figyelembe véve az összes lehetséges oldószer-konfigurációt). Tehát a molekula konformációs entrópiája nincs benne.
• Vízszintes tengelyek: a fehérjéhez tartozó konformációs szabadsági fokok. (Pl. az összes lehetséges torziós szög a fehérjében). Tehát a felület minden egyes pontja a fehérje egy konformációjának felel meg.
• Sokdimenziós felület sokdimenziós hipertérben. A 3D ábrázolások csak szemléltetések
• Az egyes molekulák a legmélyebb pontot keresik, minden molekula más-más útvonalat bejárva, miközben a hőmozgás löködi őket. A felület globális minimuma a fehérje natív állapotának felel meg, ide szánkáznak le a molekulák a tölcsér oldalán.

A fenti sima felület a legegyszerűbb, kétállapotú rendszernek felel meg.

Általános eset:

• bonyolult domborzat, dombok, gödrök, árkok, sok lokális minimum --> bonyolult felgombolyodási kinetika

Két frakcióból álló sokaság a denaturált állapotban (lizozim ilyen):

• lassan (B) és gyorsan (A) gombolyodó frakció

A Levinthal-paradoxon feloldása

Hibás kiindulópont:

Levinthal javaslata: útvonalak:

Valóság: tölcsér!

A felgombolyodás termodinamikai vagy kinetikai kontroll alatt áll?

Válasz: A natív szerkezet termodinamikai kontroll alatt áll (a szabadentalpiafelület globális minimuma). Ezt az állapotot azonban a felgombolyodás során kinetikus kontroll alatt álló intermediereken keresztül éri el a fehérje.

Mindig a globális minimum-e a natív állapot?

Nem. Ellenpélda: plazminogén aktivátor inhibitor-1

• A biológiailag aktív forma instabil, pár óra alatt átalakul egy stabilabb állapotba
• Szerkezeti változás: a lánc egy része beépül a középső béta-lemezbe
• Energiafelülete efféle:
  

A régi és az új szemlélet összehasonlítása