A felgombolyodás problémája

1. A probléma
2. A fehérjék stabil konformációs állapotai
3. A felgombolyodás általános tulajdonságai
4. A felgombolyodás modelljei
5. A felgombolyodás nyomon követésének technikái
6. A felgombolyodás kinetikai jellemzői
7. Az "új szemlélet"

A felgombolyodási probléma

Centrális dogma:
DNS --> RNS --> polipeptidlánc ?-->? működőképes konformáció

(genetikai kód második fele)


Anfinsen kísérlete (1961)

anfin.gif (11k)

Következtetés: az aminosavsorrend tartalmazza a háromdimenziós szerkezet kialakulásához szükséges összes információt. A felgombolyodás termodinamikai kontroll alatt áll: a natív szerkezet a termodinamikailag legstabilisabb állapot.


Tehát: az elsődleges szerkezet meghatározza a 3D szerkezetet. De

HOGYAN?

Ez a felgombolyodási probléma.

Alproblémák:


Az első kérdés részkérdései:


A felgombolyodási probléma jelentősége


A Levinthal-paradoxon: termodinamikai vagy kinetikai kontroll?


A fehérjék stabil konformációs állapotai


A legombolyodott (denaturált) állapot


A teljesen felgombolyodott, natív állapot


A köztes állapotok

Másképpen: kompakt denaturált állapotok. Csak akkor figyelhetők meg, ha elég sok molekula veszi fel ezeket, tehát ha eléggé stabilak.


A felgombolyodás általános tulajdonságai


A felgombolyodott állapot stabilitása

Mennyiségek és értelmezésük

A fehérjék termodinamikai paramétereinek hőmérsékletfüggése

A lizozim termodinamikai paraméterei:

td.gif (9.1k)

A felgombolyodás kooperativitása

Mi az oka a kétállapotú átmenet kooperativitásának?


A felgombolyodás modelljei


A felgombolyodás nyomon követésének technikái

Általánosan: a fehérjét denaturáló közegből gyorsan olyan környezetbe visszük, amely a natív állapotnak kedvez. Pl.

Ezután a felgombolyodás folyamatát követjük.


A felgombolyodás beindításának módszerei


A felgombolyodás követésének módszerei

fizm.gif (36k)

TulajdonságMódszerFelbontásMit mér?
A hidrofób mag szorossága Belső fluoreszcencia<1 msFőleg a triptofánok orientációja és környezete
Ultraibolya elnyelésmsFőleg a tirozinok orientációja és környezete
Külső (ANS) fluoreszcenciamsHidrofób foltok és árkok képződése, felbomlása
Fluoreszcencia quenchingmsA triptofánok elszigeteltsége külső, hidrofil quencherektől
Ciszteinil quenching10 sA ciszteinek védettsége hidrofil reagensektől
A molekula mérete Fluoreszcencia anizotrópiájamsA triptofánok mozgékonysága és kb. molekulaméret
Fluoreszcenciás energiatranszfermsTriptofán és egy kovalensen kapcsolt fluorofór távolsága
Kisszögű röntgenszórás<100 msÁtlagos girációs sugár
Kvázielasztikus fényszórás1 sÁtlagos girációs sugár
Másodlagos szerkezet és tartós H-kötések Cirkuláris dikroizmus távoli UV-benmsSzekvenciára és populációra átlagolt gerinckonformáció
"Pulse-labelling" NMR5-10 msHol vannak stabil amid és triptofán H-kötések
"Pulse-labelling" tömegspektroszkópia5-10 msHidrogénkötések képződése diszkrét intermedierekben. Heterogén populációt felbontja!
Harmadlagos szerkezeti kontaktusok, natív szerkezet megléte Biológiai aktivitásms-sNatív szerkezet az aktív helyen
Megszakított felgombolyodás10 msDiszkrét intermedierek legombolyodási sebessége (mint stabilitásuk mértéke)
CIrkuláris dikroizmus közeli UV-benmsStabil kontaktusok aromás csoportok között, diszulfidhidak
Valós idejű NMR1 sSpecifikus kontaktusok oldalláncok között
Mutációs vizsgálatok Az egyes oldalláncok energiajáruléka a diszkrét intermedierek stabilitásához


Az átmeneti állapotok jellemzése


A felgombolyodás kinetikai jellemzői

transit.gif (2.5k) kf a felgombolyodás, ku a legombolyodás sebességi állandója. A sebességi állandók kapcsolata az aktiválási energiákkal: kf=Afe-Ea,f/RT, ku=Aue-Ea,u/RT. Az egyensúlyi állandó: Keq=kf/ku


A sebességi és egyensúlyi állandók tipikus hőmérsékletfüggése (Arrhenius-ábrázolás és Van't Hoff-ábrázolás)

fkin.gif (4.5k)

Kinetikai modellek


A felgombolyodás realisztikusabb sémája

tolcs.gif (20k)

(a) legombolyodott molekulák
(b) hidrofób kollapszus, megjelenő másodlagos szerkezeti elemek, nukleációs helyek
(g) a végcél: a natív fehérje, jobbkezes hélixköteg
(f) rossz konnektivitású konformáció
(d) rossz topológia: balkezes elrendeződés (hibás)
(e) megfelelő elrendeződésű, de még laza állapot
(c) a nem megfelelő köztitermék újból legombolyodhat
(c') vagy átrendeződhet.

Tölcsér: a folyamat során egyre csökken a hozzáférhető állapotok száma (entrópia)


Az "új szemlélet"

Az új szemlélet kulcsfogalma: energiafelület

smooth.gif (32k)

Felgombolyodási tölcsér


A fenti sima felület a legegyszerűbb, kétállapotú rendszernek felel meg.

Általános eset:

bumpy.gif (34k)

Két frakcióból álló sokaság a denaturált állapotban (lizozim ilyen):

moat.gif (36k)

A Levinthal-paradoxon feloldása

Hibás kiindulópont:

golf.gif (15k)

Levinthal javaslata: útvonalak:

golfg.gif (11k)

Valóság: tölcsér!

A felgombolyodás termodinamikai vagy kinetikai kontroll alatt áll?

Válasz: A natív szerkezet termodinamikai kontroll alatt áll (a szabadentalpiafelület globális minimuma). Ezt az állapotot azonban a felgombolyodás során kinetikus kontroll alatt álló intermediereken keresztül éri el a fehérje.


Mindig a globális minimum-e a natív állapot?

Nem. Ellenpélda: plazminogén aktivátor inhibitor-1

pai.gif (10k)

A régi és az új szemlélet összehasonlítása

 Régi szemlélet Új szemlélet
SzínpadÚtvonalEnergiafelület (tölcsér)
SzereplőkJól elkülönülő, határozott szerkezetű, megjelölhető állapotok (pl. N, D, I1, I2, stb.) A konformációk heterogén, dinamikus sokaságai
TörténésEgymás után, meghatározott sorrendben történő események sorozataSok párhuzamos szálon futó, diffúziószerű mikroszkopikus események
Kísérleti háttérHagyományos, optikai jelek változásain alapuló mérésekModern módszerek (pulse-labelling NMR és tömegspektroszkópia, mutációs vizsgálatok, gyors, lézerindítású mérések)
Elméleti alapKlasszikus kémiai reakciókinetikaStatisztikus fizika: spinüveg-modellek és rácsmodellek