Prolinizomerizáció. A diszulfidhidak képződése.

1. Prolinizomerizáció
   • A prolin cisz és transz állapota
   • A prolinizomerizációs hipotézis
   • A prolinizomerizáció próbái
   • Mutációs kísérletek
   • Nagyobb fehérjék
   • A prolinizomerizáció katalízise in vivo
2. A diszulfidhidak képződése
   • A diszulfidhidak kémiája
   • Diszulfidreagensek
   • A felgombolyodás elemzése diszulfidhidas intermedierek révén
   • Az intermedierek csapdába ejtése
   • A csapdába ejtett intermedierek jellemzése
   • Diszulfidhidak révén feltérképezett felgombolyodási útvonalak
   • A kinetikus intermedierek szerepének és fontosságának meghatározása
   • Protein diszulfid izomeráz

Prolinizomerizáció

• Felgombolyodás kinetikája ált. többfázisú
  • gyors fázis: 1 ms - 1 s
  • lassú fázis: 10 s - 1000 s
• A lassú fázis adja az amplitúdó nagy részét pl.:
  RNáz A, RNáz T1, tioredoxin, triptofán szintáz
• A gyors fázis dominál, de lassú is van:
  lizozim, Staphylococcus nukleáz, citokróm c, ubiquitin, BPTI, barnáz
• A lassú fázisok hátterében gyakran prolinizomerizáció áll.

A prolin cisz és transz állapota

• A peptidkötés lehet transz (omega=180 fok) v. cisz (omega=0 fok)
• Nem Pro aminosavak: cisz állapot nagyon kedvezőtlen, ezért az egyensúlyi állandó [transz]/[cisz] értéke 100-1000 körüli
• Pro-nál:
  
  nincs akkora eltérés, ezért az egyensúlyi áll. kb.
  [cisz]/[transz] = 0,4
  azaz kb. 30% cisz, 70% transz.
• Pro-izomereket csak NMR-rel lehet kimutatni, optikailag nem.
• Kis peptideken vizsgálták, izomerizáció lassú (300 s időállandó körül)
• Fehérjékben: a natív szerkezetben a Pro-k meghatározott izomerizációs állapotban vannak
• Cisz-Pro-t tartalmazó fehérjéknél a felgombolyodás lassú fázisa dominál

A prolinizomerizációs hipotézis

Brandts, Halvorson és Brennan 1975:

• A natív állapotban mindegyik prolinnak meghatározott izomerizációs állapotban kell lennie
• A legombolyodott állapotban mindegyik prolin a 0,4-es egyensúlyi állandó szerint viselkedik, ezért sok nemnatív izomer van
• Azok a legombolyodott molekulák, amelyekben mindegyik Pro a natívnak megfelelő izomerizációs állapotban van, gyorsan felgombolyodnak, a többiek lassan

Újabb kiegészítés: Natívszerű állapotban is lehetnek nemnatív Pro-izomerek (sőt, ált. ilyenek vannak)

A prolinizomerizáció próbái

A kettősugrási próbák

Kettős ugrás: ugrások a denaturálószer-koncentrációban. Két változat:

1. Lassan felgombolyodó denaturált formák kimutatására:
   
   (Tegyük fel: a natív formában 1 db cisz-Pro van.)
   
   • Natív állapotot (N(c)) tömény denaturálószerrel denaturáljuk (1. ugrás)
   • Adott t inkubációs ideig hagyjuk a cisz és transz állapotok egyensúlyát beállni a legombolyodott állapotban (U(c) <--> U(t))
   • Ekkor kihigítással eltávolítjuk a denaturálószert (2. ugrás)
   • Mérjük a natív állapot elérését; a lassú fázis amplitúdója arányos lesz az inkubálási idő alatt keletkezett U(t) (lassan gombolyodó forma) mennyiségével
   • Ábrázolás: lassú fázis amplitúdója az inkubációs idő függvényében
   • Tipikus eredmény:
     
     A kapott görbe jellemzői (időállandó, függés hőmérséklettől, pH-tól) ált. igen hasonlóak a modellpeptideken végzett prolinizomerizációs mérések eredményeivel
2. Natívszerű Pro-izomerizációs intermedierek kimutatására:
   
   
   • Denaturált állapotból (izomerek egyensúlya) indulunk ki, denaturálószerben
   • Kihigítással hirtelen eltávolítjuk a denaturálószert (1. ugrás)
   • Natív formák (N(c)) és natívszerű izomerek (I_N(t)) keletkeznek, utóbbiak lassan átmennek natívba. t inkubációs ideig hagyjuk zajlani
   • Hirtelen hozzáadunk annyi denaturálószert, hogy az instabilabb I_N(t) izomerek (intermedierek) legombolyodjanak, de az N(c) natívak megmaradjanak (2. ugrás)
     • Alternatív megoldás: annyi denaturálószert adunk, hogy a natívak is legombolyodjanak
   • A legombolyodás amplitúdója arányos lesz az inkubációs idő alatt megmaradt I_N(t) mennyiségével
   • Ábrázolás: a legombolyodás amplitúdója az inkubációs idő függvényében
     • Alternatív megoldásnál: a natív forma más időállandóval gombolyodik le, így annak az amplitúdója is meghatározható
   • Tipikus eredmény:
     
     Az intermedier tranziens módon halmozódik fel. Az időállandókat az intermedier szerkezete befolyásolja (eltérhet a modellpeptideken mérhetőtől)

Izomerspecifikus proteolízis

• Számos proteáz izomerspecifikus
• Pl. tripszin: Töltött oldallánc mellett hasít, de csak akkor, ha a következő kötés transz
• proteolízis sebessége arányos a transz állapot koncentrációjával, ill. kétfázisú a kinetika, és a lassú fázis amplitúdója a cisz állapot koncentrációjával arányos
• Pl. RNáz A:
  
  -Lys91-Tyr92-Pro93-
  
  kísérlet szerint: legombolyodott állapotban 33% cisz.
• Nem mindig egyezik más mérési módszerek eredményeivel (pl. NMR), mert a szerkezet befolyásolja a kötés hozzáférhetőségét.

Mutációs kísérletek

• Több fehérjén: izocitokróm-c, tioredoxin, RNáz T1, RNáz A
• Ált. Pro kicserélése másra eltünteti a felgombolyodás lassú fázisait, de különféle bonyodalmak léphetnek fel
• élesztő izocitokróm-c:
  • Két lassú felgombolyodási fázis: 1. 10 s, 2. 100-200 s
  • Két cisz-Pro: 76 és 30
  • Pro76 cseréje másra --> 2. lassú fázis eltűnik
  • Pro30 cseréje másra: instabil fehérje
• RNáz A:
  • 1 gyors és 2 lassú fázis
  • Két cisz-Pro: 93 és 114
  • Kettős mutáns (mindkét prolin kicserélve): egyfázisú felgombolyodás, bár lassabb, mint a vad típus gyors fázisa (a fehérje instabilabb)
  • Pro114 cseréje: lassú fázisok amplitúdója csökken
  • Pro93 cseréje: megmaradnak a lassú fázisok, igen komplex kinetika; valószínűleg cisz peptidnek kell kialakulnia

Nagyobb fehérjék

• 3-nál több Pro esetében a lassú fázisok dominálnak (akkor is, ha egyik sem cisz a natív állapotban)
• 20 db Pro esetében az időállandó kb. 600 s
• Minden 10 újabb Pro megtízszerezi az időállandót

A prolinizomerizáció katalízise in vivo

Peptidil-prolil cisz/transz izomerázok

Három család:

1. ciklofilinek
   • ciklosporin (immunoszupresszáns szer) receptora (immunoszupressziónak nincs köze a Pro-izomerizációhoz)
   • kb. 17 kDa
   • aktivitása kevéssé függ a Pro előtti oldallánctól
2. FKBP család
   • FK506 (szintén immunoszupresszáns szer) binding protein
   • riboszómán is előfordul ilyesféle
   • 12-13 kDa
   • aktivitása erősen függ a Pro előtti oldallánctól
3. parvulinok

• Még több típus lehet
• Nem tudjuk, mennyire fontosak in vivo. Élesztőben összeset kiütve semmi káros hatás.
• Katalízis mechanizmusa: korábban SH-reakcióra gyanakodtak, de ez megdőlt. Vsz. a szubsztrát szerkezetét eltorzítja
• De novo szintézisben szerepe lehet
• Átstrukturálódásban szerepe lehet, pl. C típusú mannózkötő fehérje Ca-mentes (inaktív) alakjában a Pro191 transz, az aktivált, Ca-os alakjában cisz.

A diszulfidhidak képződése

• Hogyan alakulnak ki a diszulfidhidak a felgombolyodás során?
• A diszulfidhidas intermedierek jól vizsgálhatók, kinetikai szerepük megbízhatóan azonosítható, a szerkezetről információt ad a diszulfidhidak elhelyezkedése. Tehát a felgombolyodásról sokat mond.

Felvethető kérdések:

• A diszulfidhidak határozzák meg a szerkezetet vagy a szerkezet a diszulfidhidakat?
• Vannak-e a felgombolyodás folyamatában nemnatív diszulfidhidak, mi ezek szerepe?
• Egy vagy több felgombolyodási útvonal van?
• A felgombolyodás sebessége fehérjénként nagyon eltérő. Miért?
• In vivo ugyanúgy történik-e a felgombolyodás, mint in vitro?
• A felgombolyodást katalizáló enzimek (itt: diszulfid izomeráz) megváltoztatják-e a felgombolyodás mechanizmusát, vagy csak gyorsítják?

Vigyázat! Az eddigi vizsgálatok kis fehérjékkel történtek. Nagy fehérjékre nem feltétlenül általánosíthatóak.

A diszulfidhidak kémiája

A reakció

• Két SH csoport (tiol) magától nem képez diszulfidhidat, csak ha megfelelő oxidálószer van jelen.
• Levegő oxigénje is elvégzi, de ez káros (nem kontrollálható, nemkívánatos melléktermékek, stb.), ezért a levegőt és egyéb oxidálószereket ki kell zárni
• Jobb: diszulfidreagens alkalmazása (RSSR), tiol-diszulfid cserés reakció
• Diszulfidhíd képződése fehérjében:
  1. lépés:
  
  Vegyes diszulfid képződése
  2. lépés:
  
  Intramolekuláris lépés: egy második Cys tiolcsoportja reagál a vegyes diszulfiddal, így létrejön a diszulfidhíd

  A második lépés sebessége (k_intra) elsősorban azon múlik, mennyire hajlamos a két Cys egymás közelébe jönni (konformáció)

• Mechanizmus:
  
  Lényeg: A tiolátanion nukleofil támadása a diszulfidkötés egyik kénje ellen.
  • Cys-SH pK-ja kb. 8,7, függ a környezettől. 8,7 körüli pH-t kell alkalmazni. Alacsony pH leállítja a diszulfidhidak képződését.
  • Pozitív töltések a közelben gátolják, negatívok segítik a diszulfidhíd képződését

Egyéb intramolekuláris reakciók

• Vegyes diszulfid áthelyeződése a fehérjében
• Diszulfidhíd áthelyeződése a fehérjében (átrendeződés)

A diszulfidhíd kialakulásának valószínűsége

• A szerkezet befolyásolja
• legombolyodott láncban: a két Cys közötti aminosavak számától függ (m)
• nagy m-eknél m^-3/2 -nel arányos.
• Kis m-eknél páros m-re nagyobb, páratlanra kisebb, m=0-ra nagyon kicsi (cisz peptidkötés kell hozzá)

Diszulfidreagensek

• glutation (gamma-Glu--Cys--Gly tripeptid)
  • GSH tiolforma, GSSG diszulfidforma (intermolekuláris)
  • in vivo is ez a domináns
  • nem változtatja meg a fehérjekonformációt
  • egy negatív töltést hordoz (elemzéshez előnyös)
• Ditiotreitol
  
  
  • DTT_SH^SH tiolforma, DTT_S^S diszulfidforma (intramolekuláris)
  • lassan oxidál, csak a legkedvezőbb diszulfidhidakat hozza létre
  • vegyes diszulfidos termék nem halmozódik fel
• Más-más kinetikai paraméterek nyerhetők a kétféle reagens alkalmazásával
• A fehérje oxidáltsági foka szabályozható a diszulfidreagens tiol/diszulfid arányának beállításával

A felgombolyodás elemzése diszulfidhidas intermedierek révén

• Teljesen redukált, legombolyodott fehérje felgombolyodását elindítjuk diszulfidreagensek jelenlétében
• Adott időpontokban leállítjuk ("kioltjuk") a diszulfidhidak képződését
• Az így csapdába ejtett formákat megvizsgáljuk (diszulfidhidak és konformáció szempontjából)

Az intermedierek csapdába ejtése

A diszulfidhidak képződése megállítható:

• Hirtelen lecsökkentjük a pH-t (pl. 2-re)
  • igen gyors, pillanatszerű hatás
  • nem áll le a diszulfidok képződése, csak jelentősen lelassul, elemzés végezhető, de sietni kell
  • előnye, hogy megfordítható: újból megemelve a pH-t a folyamat folytatódik
• Alkilálás jódacetáttal vagy jódacetamiddal
  • Irreverzibilis, nem kell sietni az elemzéssel
  • Lassabb reakció, közben szerkezeti változások történhetnek a fehérjében
  • Jódacetát egy negatív töltést visz fel, jódacetamid töltetlen. Ez elemzéshez előnyös

A csapdába ejtett intermedierek jellemzése

Hány diszulfidhíd van és hol?

• Bármilyen elemzés végezhető, ami a diszulfidhidakat nem bántja. Savas pH-t kell fenntartani, semmi nukleofil vegyület.
• Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE): töltés és konformáció szerint is szeparál (hidrodinamikai térfogat)
  • Jódacetamidos (töltetlen) és jódacetátos (töltött) formák PAGE-jének összehasonlítása: diszulfidok száma kiszámítható
  • Redukált, vegyes diszulfidos és diszulfidhidas formák elkülöníthetők
    
    
  • Jódacetamid-jódacetát keveréket alkalmazva, a keverékarányt változtatva megszámlálhatóak a szabad SH-csoportok (ill. redukció után alkalmazva a diszulfidhidak)
    
    
• Kromatográfia (pl. ioncserélő, HPLC-vel)
  
  

  Tisztán elkülönülnek a különböző formák

• Hol vannak a diszulfidhidak? Diagonális elektroforézis
  
  
  • Pl. jódacetátos formával
  • Proteázokkal darabokra hasogatjuk (pl. tripszin + kimotripszin)
  • Előbb vízszintes irányban elektroforézis (papír)
  • Perhangyasav gőzének kitéve a meglévő diszulfidhidak elhasadnak
  • Elektroforézis újból, függőleges irányban
  • Ami az első futtatásnál össze volt kötve diszulfidhíddal, az a második futtatásnál szétválik
  • A fragmentumokat pl. aminosavösszetétel alapján azonosítjuk

Diszulfidhidak révén feltérképezett felgombolyodási útvonalak

• Csak néhány fehérjére végezték el: BPTI (bovine pancreatic trypsin inhibitor: marha hasnyálmirigy tripszininhibitor), RNáz A, RNáz T1, alfa-laktalbumin, stb.
• BPTI
  
  58 aminosav, egy béta lemez és egy hélix. Három diszulfidhíd: 14-38 felszíni, 30-51 és 5-55 eltemetett
• Diszulfidos felgombolyodási kinetika:
  
  
  • A redukált BPTI denaturálószer nélkül is csaknem teljesen legombolyodott
  • A felgombolyodás során legalább 8 különböző diszulfidos forma lép fel (elvben 74 lehetne!)
  • Komplex kinetika
  • Két nemnatív diszulfidos forma: (30-51,5-14) és (30-51,5-38)
  • Egy nagyon lassú szakasz: a (30-51,5-55) kialakulása a nemnatív formákból
  • Egy zsákutca: (5-55,14-38)

Szerkezeti háttér (egyéb mérések segítségével)

• Legkorábbi szakasz: véletlenszerű diszulfidhidak, a láncban vett távolságuknak megfelelő valószínűséggel
• A natív szerkezet felé haladás irányítja a diszulfidhidak kialakulását
• Bonyodalmak:
  • Kvázinatív szerkezetek
  • Kinetikus gátak
• Kvázinatív szerkezet: eltemetődött két Cys, anélkül, hogy köztük létrejött volna a diszulfidhíd. Itt: (30-51,14-38): az 5 és 55 eltemetődött. Mivel eltemetődve nem tud oxidálódni, előbb részlegesen le kell gombolyodnia
• Kinetikus gátak: natív szerkezethez vezető, eltemetett diszulfidhíd létrejötte nehéz, mert a kémiai reakció az eltemetődéshez és a natív szerkezet kialakulásához csatolt; nagy az energiagát. Itt: az 5-55 létrejötte a 30-51-es mellett
• A nemnatív formák szerepe?
  • Korábban bajnak gondolták, igyekeztek jelentéktelennek minősíteni
  • Ma tudjuk: a (30-51,5-14) és (30-51,5-38) formák részlegesen felgombolyodottak, a nemnatív diszulfidhidak a flexibilis részben jönnek létre
  • Szerepük döntő fontosságú: az 5-55 natív diszulfidhíd ezekből jön létre átrendeződéssel!

A kinetikus intermedierek szerepének és fontosságának meghatározása

• BPTI: Weissman és Kim szerint a (30-51,14-38) intermedier a legfontosabb, mert nagy mennyiségben halmozódik fel. A két nemnatív intermedier lényegtelen melléktermék
• Creighton szerint: épp fordítva van! Két szempont:
  • A molekulák mekkora része megy át az adott formán?
  • Milyen mértékben lassul le a reakció, ha az adott forma nem jöhet létre?
• Kísérleti eredmény: ha a 14-et vagy a 38-at (nem mindkettőt) blokkoljuk vagy mutáljuk, akkor nem változik meg lényegesen a mechanizmus és az időskála
• A (30-51,14-38) csak azért halmozódik fel, mert stabil kvázinatív állapotban van, kinetikus csapdába ejtve
• Ezzel szemben a nemnatív formák szerepe döntő, bár kis mennyiségben jelennek meg

Protein diszulfid izomeráz

• Endoplazmatikus retikulumban (ER) található, ide kerülnek a membrán- és a szekretált fehérjék (ezekben van diszulfidhíd)
• GSH-GSSG arány itt 1:1 v. 3:1 körüli, oxidálóbb a citoplazmánál
• Tioredoxin doménekből áll, aktív hely: CGHC
• diszulfid-átrendeződéseket katalizál:
  
• kovalensen kötődik a fehérjéhez, majd háromféleképpen mehet tovább a folyamat:
  • piros: visszaalakulhat az eredeti diszulfidhíd
  • zöld: intramolekuláris átrendeződések: reaktívabb diszulfidok kevésbé reaktívakkal cserélődnek fel
  • kék: a PDI oxidálódva leválik, majd valahol másutt oxidál (egy idő múlva, ha a másik két útvonal nem megy, ez következik be, így nem maradhat rajta az enzim a fehérjén)
• Chaperon funkciója is van: aggregációt gátol (lefedve a hidrofób felszíneket)
• Antichaperon funkció: bizonyos körülmények között (redukáló közeg, kis koncentráció) aggregációt segít elő (ez in vivo reverzibilis lehet és pl. a degradációtól való védelmet szolgálhatja)