A felgombolyodás vizsgálata irányított mutációk segítségével

1. Bevezetés
2. Elmélet
   1. Reakcióséma és a látszólagos energiakülönbségek
   2. A valódi energiakülönbségek
   3. A globális energiák és az egyedi kölcsönhatások viszonya
   4. értékek
   5. Kétszeres mutációk ciklusai
   6. A felgombolyodás elemzése mutánsok segítségével
   7. A látszólagos energiák mérése
3. Barnáz
   1. Egyensúlyi kísérletek barnázzal
   2. Kinetikai kísérletek barnázzal
   3. A barnáz felgombolyodása
   4. Értékelés

Bevezetés

• "Protein engineering" (fehérjetervezés): hatékony eszköz
  • viszonylag könnyen megvalósítható (génsebészetben rutinfeladat)
  • szerkezet-funkció, szerkezet-stabilitás, stb. vizsgálatok
• Felgombolyodásnál
  • mutánsokat készítünk
  • ezek felgombolyodását mérjük
  • mindegyik mutáció az adott pozícióban zajló események próbája
  • szerkezeti információt ad
  • energetikai információt ad

Stratégia

1. A térszerkezet alapos vizsgálatával kiválasztjuk azokat az oldalláncokat, amelyek a stabilitásban fontos szerepet játszhatnak
2. Ezeket irányított mutagenezissel módosítjuk
3. Egyensúlyi és kinetikus felgombolyodási kísérleteket végzünk
4. A mért paraméterek alapján felvázoljuk a mutáns és a vad típusú fehérje ún. szabadentalpia-profilját
5. Elkészítjük az energiakülönbségek diagramját
6. Levonjuk a következtetéseket az egyes kölcsönhatásokról

A mutációk kiválasztása

• specifikus kölcsönhatást szüntessenek meg
• a szerkezetet a lehető legkevésbé zavarják meg
• térképezzék fel az összes fontos régiót

Kerülendő:

• komplex mutációk, melyek több kölcsönhatást befolyásolnak (nehéz értelmezni)
• "bomlasztó", a térszerkezet átrendeződéséhez vezető mutációk (nehéz értelmezni, felgombolyodás útvonalát is befolyásolhatják):
  • nagy csoport bevitele
  • új kölcsönhatásokat létesíteni képes csoport bevitele
  • ellentétes töltésű párral rendelkező eltemetett töltés eltávolítása
  • nagyméretű csoport eltávolítása

Elmélet

Reakcióséma és a látszólagos energiakülönbségek

U: legombolyodott, I: intermedier, ++: átmeneti állapot, F: felgombolyodott, vesszős: mutáns

G_F-U = G_F-U - G'_F-U
G_ts-U = G_ts-U - G'_ts-U
G_I-U = G_I-U - G'_I-U

(Pl. a natív állapot esetében a denaturált állapothoz viszonyított szabadentalpia eltérése a vad és a mutáns között.)

(Az "energia" alatt itt most mindig szabadentalpiát értünk!)

(az U állapotot referenciának vettük, ezért a vad és a mutáns diagramja úgy van egybecsúsztatva, hogy az U szintjeik egybeessenek)

A valódi energiakülönbségek

Ami érdekel minket:az egyes állapotok szabadentalpiájának változása a mutáció hatására (G_F, G_ts, G_I, G_U, vagyis a valódi energiakülönbségek.

(Pl. a natív állapot esetében az állapot szabadentalpiájának változása a mutáció hatására.)

Termodinamikai ciklusokban körbemenve az energiák előjeles összege zérus kell legyen, ezért a fentebbi séma alapján:

G_F = G_F-U + G_U
G_ts = G_ts-U + G_U
G_I = G_I-U + G_U

Tehát a látszólagos energiák a konstans G_U taggal térnek el a valódiaktól.

(a valódi energiaviszonyok: az U állapotok nincsenek egybecsúsztatva. Vigyázat, itt a legombolyodott állapot bal oldalon van!)

G_U: a legombolyodott állapot szabadentalpiájának megváltozása a mutáció hatására

• Az U állapotot referenciának véve a G_U-t vehetjük mindig 0-nak
• vagy: feltéve, hogy az U szerkezet nélküli, "véletlen gombolyag", G_U a szolvatációs energiából adódik (mérhető vagy a felszín alapján számítható)

Mivel a látszólagos energiák egy konstans taggal térnek el a valódiaktól, egyik állapotból a másikba lépve a látszólagos energiakülönbség változása megegyezik a valódi energiakülönbség-változással!

A globális energiák és az egyedi kölcsönhatások viszonya

A mért (látszólagos) G-k a teljes molekulára vonatkozó, globális mennyiségek. Hogyan függenek össze az egyedi kölcsönhatások energiáival?

A globális G-hez (a molekula teljes szabadentalpiájához) való hozzájárulások két csoport (X és Y) kölcsönhatása esetén:

• X és Y kölcsönhatása egymással
• X és Y kölcsönhatása a fehérje többi részével (E-vel)
• X és Y kölcsönhatása az oldószerrel
• E kölcsönhatása az oldószerrel

Az egyik csoport kicserélésére (X-->Z) mindezek megváltoznak, továbbá

• a szerkezet átrendeződhet (reorg)

Ezek a mennyiségek pedig eltérőek az U és F állapotban.

Mindent összegezve a stabilizációs szabadentalpia megváltozása az X-->Z mutáció hatására:

(legáltalánosabb eset)

Egyszerűsítések

A fenti egyenlet speciális esetekben egyszerűsíthető:

• Nem bomlasztó mutáció esetén: a G_reorg tagok kiesnek, Y kölcsönhatásai E-vel és a vízzel ugyanazok a vad és mutáns fehérjében
• Deléció (csoport eltávolítása) a víz számára nem hozzáférhető helyen: oldószeres tagok nagy része kiesik, Z...Y kölcsönhatás kiesik
• Deléció a víz számára hozzáférhető helyen: az X...Y kölcsönhatást víz...Y váltja fel, Z...Y nincs
• Helyettesítés (az eredetivel megegyező méretű csoporttal)
• Izosztérikus helyettesítés (az eredetivel megegyező geometriájú csoporttal, pl. Val-->Thr)

(3-4 tagú egyenletek)

értékek

: RELATÍV DESTABILIZÁCIÓ. Az S (tetszőleges) állapotra (S lehet az U, az I, a ts vagy az F):

_S = G_S-U/G_F-U

0 és 1 közé esik. Jelentése: a mutáció mennyire destabilizálja az S állapotot, az F állapot destabilizációjához viszonyítva.

• =1: az S állapotot ugyanúgy érinti a mutáció, mint az F-et. Tehát a mutáció által elvett kölcsönhatás S-ben is megvan.
  • (vagy: nincs meg, de ugyanakkora energiájú másik kölcsönhatás jön létre)
• =0: az S állapotot nem érinti a mutáció. Tehát a mutáció által elvett kölcsönhatás S-ben nincs meg.
• 0<<1:
  • az S állapotban részlegesen van meg a kölcsönhatás, vagy
  • a molekulák egy részében megvan, más részében nincs

Feltevések

A bemutatott elemzés feltételei:

1. A mutáció nem változtatja meg a felgombolyodás útvonalát (G_ts,reorg és G_I,reorg elhanyagolható)
2. A mutáció nem változtatja meg jelentősen sem a felgombolyodott, sem a legombolyodott állapot szerkezetét (G_F,reorg, G_U,reorg elhanyagolható)
3. A vizsgált csoport a felgombolyodás során nem létesít más csoportokkal más kölcsönhatásokat, mint a natív szerkezetben
4. A legombolyodás ugyanazon az úton történik, mint a felgombolyodás, csak visszafelé [ez némely esetben igazolható]

Kétszeres mutációk ciklusai

Az egyszeres mutációk problémái:

• Nem derül ki, ha a csoport a felgombolyodás során más csoporttal létesít kölcsönhatást, mint a natív állapotban
• A csoportok kölcsönhatása a fehérje többi részével bonyolítja az elemzést

Hogyan vizsgálható közvetlenül két csoport kölcsönhatása? Kettős mutációs ciklussal!

Négy változatot vizsgálunk:

• vad típus E-XY
• egyszeres mutáns Y-ban: E-X
• egyszeres mutáns X-ben: E-Y
• kettős mutáns: E

(szögletes zárójelben az egyes állapotok szabadentalpiájában szerepet játszó tagok)

Kölcsönhatási energia (G_int): mennyivel módosul az egyik mutáció hatása, ha a másik mutáció is megvan:

G_int = G_E-XY->E-X - G_E-Y->E = G_E-XY->E-Y - G_E-X->E

Hogy adható meg a kölcsönhatási energiákkal?

Ha a mutáció nem bomlasztó, a reorganizációs tagok elhanyagolhatóak, más tagok kiesnek, így

G_int = G_X...Y - G_X...víz - G_Y...víz

tehát az X...Y kölcsönhatás és a szolvatációs tagok különbsége.

Ha a víz nem fér hozzá a mutált helyhez, akkor G_int=G_X...Y ! (maga a kölcsönhatási energia!)

• G_int bármely S állapotra kiszámítható (G_S,int)
• Relatív kölcsönhatási energia: _S,int=G_S,int/G_F,int: azt mondja meg, hogy az S állapotban milyen mértékben van meg az adott kölcsönhatás, a felgombolyodott állapothoz képest.
• kiterjeszthető magasabb dimenziókra: hármas mutáns ciklusok, stb. (kölcsönhatások kooperativitásának tesztelése)

A felgombolyodás elemzése mutánsok segítségével

• Elkészítjük a vad és a mutáns fehérje szabadentalpia-profilját (a)
• Kiszámítjuk az egyes állapotok értékeit (b)
• A -diagramból következtetünk a kölcsönhatás jelenlétére a felgombolyodás folyamatának egyes állomásain

Példák:

Lehetséges forgatókönyvek (mely fázisban jön létre a kölcsönhatás)

• (a) csak F-ben
• (b) ts-ben
• (c) már I-ben
• (d) I-ben gyengén, ts-ben erősebben, de teljesen csak F-ben

A látszólagos energiák mérése

Hogyan mérjük meg a -mennyiségeket?

• A felgombolyodott állapotra vonatkozó látszólagos energia egyensúlyi denaturációból származtatható (vadra és mutánsra)
• Az átmeneti állapotra vonatkozó látszólagos energiák a legombolyodás sebességi állandójából számíthatóak (mutánsra és vadra megmérve)
• Az intermedierekre vonatkozó látszólagos energiák a le- és felgombolyodás sebességi állandóinak hányadosából számíthathatóak (mutánsra és vadra megmérve)

(k_uaz F-I átmenet, k_-u az I-F átmenet sebességi állandója)

A értékek:

_I = G_I-U/G_F-U
ts = G_ts-U/G_F-U

Barnáz

• Bacillus amyloliquefaciens ribonukleáz

  

  110 aminosav, 3 hélix, egy ötszálú antiparallel béta-lemez

• Részletes szerkezet:
  
  
  • hélix₁ (leghosszabb): béta lemezzel core₁ hidrofób mag
  • lemez másik oldalán loop₃ és loop₅ hurokrégiók a béta-lemezzel képezik a core₃ hidrofób magot
  • hélix₂ és hélix₃ a lemez élével képezik a core₂ hidrofób magot
  • aktív helyet a loop₃ és loop₅ közti hasadék képezi
• Jó tulajdonságai:
  • Denaturálószerrel és hővel reverzibilisen denaturálható
  • Egyensúlyi fel/legombolyodása kétállapotú
    
  • Nincs benne cisz-prolin

Egyensúlyi kísérletek barnázzal

Az egyes kölcsönhatások szerepének feltérképezése: több mint 60 mutáns elemzésével (Alan Fersht és mtsai, Cambridge)

Elektrosztatikus kölcsönhatások

• Felszíni középtávúak (<10 angström): igen kicsi a járulékuk.
• Rövidtávúak (<3,5 angström): csekély a járulékuk: 0,3-1 kcal/mol
• Eltemetett ionpárok: egyik töltést eltávolítva nagy destabilizáció (3-4 kcal/mol)
• (magas hőmérsékleten nagyobb lehet a felszíni ionpárok stabilizáló hatása is! ld. termofil fehérjék)

Hidrogénkötések

Háromféle mutáció:

• A hidrogénkötésben részt vevő csoport eltávolítása (pl. Ser->Ala, Tyr->Phe)
  • Felszínen: destabilizáció < 0,5 kcal/mol
  • Eltemetett, töltetlen csoportok között: destabilizáció 1-1,5 kcal/mol
  • Eltemetett, töltött csoportok között: destabilizáció 3-4 kcal/mol
• Nagyobb rész eltávolítása (pl. Asp, Gln, Asn -> Ala):
  más kölcsönhatásokat is befolyásol. Destabilizáció: 2-3 kcal/mol

Hidrofób kölcsönhatások

• Egy eltemetett metil(én)csoport eltávolítása átlag 1,5 kcal/mol destabilizációt okoz
• A destabilizáció arányos az eltávolított csoporttól 6 angströmnél nem messzebb lévő metil(én)csoportok számával:
  
• A destabilizáció annál nagyobb, minél jobb az eredeti térkitöltés

A hidrofób kölcsönhatás adja a legnagyobb járulékokat, a hidrogénkötések és az elektrosztatikus kölcsönhatások viszont a natív szerkezet specificitásában játszanak nagy szerepet.

Kinetikai kísérletek barnázzal

• Felgombolyodás kétfázisú, lassú fázis prolinizomerizáció miatt

  Chevron plot a gyorsabb fázis sebességi állandójából:

  
  
• Az adatok egy kinetikus intermediert tartalmazó reakció egyenleteire illeszthetőek
  U <--> I <--> ts <--> F
  
  

-elemzések: Több mint 40 mutáns segítségével elemezték a felgombolyodás folyamatát (Fersht). Ötféle mutáns:

• hélixekben (dupla mutációs ciklusok is)
• béta-szálakban
• béta-kanyarokban
• hidrofób magokban
• hurkokban

A barnáz felgombolyodása

Hidrofób magok

(bal: I áll., közép: ts áll., jobb: natív
szaggatott vonal: legombolyodott; vékony: részleges; vastag: felgombolyodott)

• A core₁ mag az I állapotban elkezd kialakulni, ts-ben megerősödik. A közepe előbb megjelenik és erősebb, mint a széle.
• A core₂ mag csak a ts állapot után alakul ki
• A core₃ mag az I állapotban elkezd kialakulni, ts-ben már kompakt

Hurkok:

• A loop₂, loop₄ és a loop₁ egy része csak a ts állapot után alakul ki
• A loop₃ (szubsztrátkötő) már az I állapotban kialakul, a loop₅ is részlegesen

Béta-szerkezet

• A béta-lemez közepe az I állapotban lényegében kialakult, de a szélei gyengék

Hélixek

• A hélix₁ N-terminális egyharmada az I állapotban laza, a maradék kétharmad rész viszont már lényegében megvan
• A hélix₂ csak a ts állapot után alakul ki

Értékelés

• Mutánsok elemzésével meglepően pontos képet lehet kapni a felgombolyodás folyamatáról
• A mutációs elemzésből kapott eredményeket összehasonlították az NMR-rel követett hidrogénkicserélődési mérések eredményeivel
• Az egyezés jó
• A mutációs elemzés elsősorban az oldalláncokról ad információt
• A hidrogénkicserélődés elsősorban a gerincről ad információt
• Együttesen alkalmazandó, komplementer módszerek