Több doménből, ill. több alegységből álló fehérjék összeszerelődése

1. A több doménből álló fehérjék felgombolyodása
   1. Domének
   2. Izolált domének felgombolyodása
   3. A doménpárosodás mint sebességmeghatározó lépés
   4. Versengés a felgombolyodás és az aggregáció között
2. A több alegységből álló fehérjék összeszerelődése
   1. Többalegységes fehérjék
   2. A több alegység szerepe a funkció szempontjából
   3. Az alegységek közötti kölcsönhatások
   4. Az alegység-asszociáció tanulmányozásának módszerei
   5. Példák többalegységes fehérjék összeszerelődésére
   6. Versengő mellékreakciók

A több doménből álló fehérjék felgombolyodása

Domének

Többféle definíció:

• Stabil egység (limitált proteolízissel vagy génsebészettel elkülöníthető)
• Termodinamikai egység (kooperatívan gombolyodik le és fel)
• Felgombolyodási egység (függetlenül gombolyodik)
• Szerkezeti egység (látszik a röntgenszerkezetben)
• Genetikai egység (szekvenciaösszehasonlítások alapján jósolható)
• Evolúciós egység (exonoknak felel meg)
• Funkcionális egység (meghatározott részfunkciója van, pl. NAD-kötés)

Izolált domének felgombolyodása

A polipeptidláncot a doménhatároknál szétvágva a domének izolálhatóak, ill. az egyes domének génsebészeti úton külön-külön előállíthatóak.

Számos izolált doménről mutatták ki, hogy önállóan, reverzibilisen fel-/legombolyodik

(triptofán szintetáz, béta-laktamáz, aszpartokináz-homoszerin dehidrogenáz, plazminogén, PGK, stb.)

A domének termodinamikai stabilitása

Speciális esetekben igazolták, hogy a domének a fehérje többi részével együtt és anélkül is nagyjából azonos stabilitásúak (ez nem feltétlenül általánosítható)

Plazminogén és különféle fragmentumainak kalorimetriás görbéi

A doménpárosodás mint sebességmeghatározó lépés

Számos jel szerint a többdoménes, egyláncú fehérjék felgombolyodásában a leglassúbb lépés a már felgombolyodott domének párosodása (asszociációja). Ennek 3 bizonyítéka:

1. Az enzimaktivitás csak a felgombolyodás legkésőbbi szakaszában jelenik meg. Az aktív hely általában a domének érintkezésénél van, az egyes domének hordozzák az egyes szubsztrátokat.
2. A felgombolyodás sebessége fordítottan arányos az oldat viszkozitásával
   
   (A: Oktopin dehidrogenáz, B: AK-HDH felgombolyodási sebességének reciproka a viszkozitás függvényében. Viszkozitásnövelők: glicerin, glükóz, szukróz

   A viszkozitástól való függés nagyméretű egység elmozdulását feltételezi

3. Az egyik doménben létrehozott, felgombolyodást lassító mutáció hatása kompenzálható a másik doménben létrehozott, önmagában szintén lassító mutációval

Létezik tehát egy állapot, melyben a domének már fel vannak gombolyodva, de még nem asszociálódtak. Ennek neve: FUD (Folded but Unpaired Domains): felgombolyodott, de még nem párosodott domének

Általános reakcióséma:

Versengés a felgombolyodás és az aggregáció között

• A FUD intermedierben a domének kontaktfelszíne szabad --> más láncok komplementer felszíneihez is kapcsolódhatnak --> aggregáció!
• Erősen koncentrációfüggő:

  Laktát dehidrogenáz aggregációja (háromszög) és felgombolyodása (kör) a fehérjekoncentráció függvényében

Az aggregációban valóban a FUD intermedier vesz részt. Ennek bizonyítékai:

1. Az aggregáció akkor a legerőteljesebb, ha részlegesen felgombolyodott molekulák nagy számban vannak jelen
2. Az aggregáció specifikus. Más fehérjék jelenléte nem befolyásolja (még hasonló fehérjéké sem)
3. Az aggregáció sokkal kisebb, ha a domének között nincs kovalens kapcsolat (izolált domének)

A több alegységből álló fehérjék összeszerelődése

Kérdések:

• Mennyiben befolyásolja az alegységek szerkezetét, stabilitását a többi alegység jelenléte?
• A felgombolyodási folyamat melyik fázisában történik az alegységek asszociációja?
• Teljesen kész, merev szerkezetű alegységek asszociálódnak, vagy inkább két olajcsepp egybeolvadásához hasonló az asszociáció? Utóbbi esetben mi biztosítja a specificitást?
• Egy "olvadt gombóc" jellegű intermedier mutathat-e specificitást?

Többalegységes fehérjék

• M_r=30 000 molekulatömeg alatt többnyire monomer, M_r=50 000 fölött többnyire oligomer fehérjék
• (Kivételek: pl. izoleucin-tRNS szintetáz (M_r=114 000) monomer; inzulin (M_r=5700) és MetJ represszor (M_r=12 000) dimerek)

Néhány negyedleges szerkezet:

Általában szimmetrikus szerkezetek:

izopropil-malát dehidrogenáz (dimer)

kloramfenikol acetiltranszferáz (trimer)

szérum amiloid P komponens

C-reaktív protein (hexamer)

LHC komplex (light harvesting complex) (nonamer)

TRAP (Trp attenuation protein) (undekamer, 11-mer)

glutamin szintetáz (dodekamer, 12-mer)

A negyedleges szerkezet és az élettani funkció összefüggése:

• Szekretált fehérjék (pl. tripszin, lizozim): ált. kicsi, egydoménes monomerek, diszulfidhidakkal --> különféle környezetekben ellenálló
• Vérplazma fehérjéi: nagy monomerek (pl. szérumalbumin 65 kD) vagy ezek oligomerjei (alfa₂-makroglobulin, 4 alegység, 4x180 kD) --> nem szűrődnek át az erek falán vagy a vesében
• Intracelluláris fehérjék: Ált. több alegység

A több alegység szerepe a funkció szempontjából

1. Az aktivitás szabályozása
2. Újfajta aktivitások létrehozása
3. Nagy szerkezetek képződése
4. A felgombolyodott láncok stabilizálása
5. Egyéb

Az aktivitás szabályozása

• Az alegységek között pozitív vagy negatív kooperativitás lehet
  • Hemoglobin (oxigénkötése)
  • foszfofruktokináz
  • aszpartát karbamoiltranszferáz
  szigmoid alakú függés a szubsztrátkoncentrációtól
  • glutamát dehidrogenáz: negatív kooperáció a NAD-kötő helyek között
• Különböző ligandumok közötti kölcsönhatás --> szabályozó funkciók (regulátor molekulák)
• A konformációváltozás ált. kimutatható

Újfajta aktivitások létrehozása

• Számos enzim aktív helye több alegység oldalláncaiból tevődik össze
  (pl. glutamin szintetáz, aszpartát aminotranszferáz, triózfoszfát izomeráz, citrát szintáz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz)
  
  Citrát szintáz aktív helye. A *-gal jelölt oldallánc a másik alegységből van
• Az alegység-asszociáció változtathat is a specificitáson:
  E. coli triptofán szintáz: triptofán bioszintézisének utolsó lépése:
  indol-glicerin-foszfát + szerin <---> triptofán + gliceraldehid-3-foszfát + H₂O

  Szerkezete: a₂b₂. 1M KSCN jelenlétében disszociál:

  a₂b₂ --> 2a + b₂

  Az a és a b₂ egységek két félreakciót katalizálnak:

  indol-glicerin-foszfát <---> indol + gliceraldehid-3-foszfát
  indol + szerin <---> triptofán + H₂O
  • Az a₂b₂ teljes enzim hatékonyabban katalizál és elnyomja a káros mellékreakciókat.
  • Az indol az a alegység aktív helyéről "channeling" révén, egy "alagúton" jut el a b alegység aktív helyére
• Laktóz szintáz: A és B alegység (a B az alfa-laktalbumin):
  • B nélkül az A N-acetil-glükózaminból N-acetil-laktózamint készít
  • B-vel glükózból laktózt
  • szabályozás: szülés után megnövekszik a B alegység szintje, így a tejcukor termelése

Nagy szerkezetek képződése

• GroEL chaperonin: gyűrű 14 alegységből, közepén lyukkal, mely befogad egy rosszul felgombolyodott fehérjét
• aktin --> aktinszál
• alfa- és béta-tubulin --> mikrotubulus
• flagellin --> bakteriális ostor

A felgombolyodott láncok stabilizálása

• Az asszociáció növeli az alegységek stabilitását (hidrofób foltokat, laza hurkokat eltüntet)
• Nehéz mérni a stabilizáció mértékét (disszociáló körülmények az alegységet is destabilizálják)
• Mérés: Mátrixhoz kötött fehérjéről a szabad alegységet ledisszociáltatjuk, a megmaradót visszagombolyítjuk, stabilitását mérjük

Egyéb szerepek

• A sejt ozmotikus nyomásának csökkentése
• A hibás felgombolyodás esélye kisebb, ha több, önálló alegységből épül fel a fehérje, mint ha egyetlen nagy láncból

Az alegységek közötti kölcsönhatások

• Ugyanazok, mint az alegységen belüliek (hidrofób, H-kötés, elektrosztatikus, Van der Waals)
• Asszociációs állandó (K): 10⁵ -- 10¹³ M^-1
  Standard szabadentalpia (deltaG^o): -28 -- -74 kJ/mol (mérésből)
• A mért deltaG^o-ben benne van a transzlációs és rotációs szabadsági fokok elvesztéséből származó járulék is. Ennek értéke vitatott. Kétféle becslés:
  • Gázok statisztikus mechanikája alapján a "Sackur-Tetrode" egyenletből --> nagy entrópiaértékek (100 cal/M/K), nehéz magyarázni
  • Keverési entrópia (a disszociálódó alegységek elkeverednek az oldatban):
    S_mix=k_B ln x

    ahol x a móltört, 1M referenciakoncentrációra (a víz koncentrációja 55M) számítva kb. 10 cal/M/K érték adódik.

  Mérés: nehéz, értékek inkább a 10 cal/M/K-hoz közeliek. Mégis, elméleti alapon a Sackur-Tetrode módszert tartják többen helyesnek.

• Becslés: az asszociációkor eltemetett hidrofób felszínből: 100 négyzetangströmönként 10,5 kJ/mol szabadentalpia (konyhaszabály)

Az alegység-asszociáció tanulmányozásának módszerei

Két megközelítés:

• Olyan körülményeket teremtünk, ahol felgombolyodott, de disszociált monomerek vannak. Ezután visszaállítva az eredeti paramétereket az asszociáció elkülönítve vizsgálható. (Ez sokszor nem járható út.)
• Disszociált és legombolyodott monomerekből indulunk ki, együttesen vizsgáljuk a monomerek felgombolyodását és asszociációját.

Disszociált natív (vagy kvázinatív) alegységek nyerése

• Higítás
  Akkor használható, ha nem túl erős az alegységek közötti kapcsolat (pl. piruvát karboxiláz, foszfofruktokináz)
• Hidegdisszociáció
  Hidrofób kölcsönhatás meggyengülése miatt. Pl. élesztő gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (tetramer) 0 Celsius-fokon kvázinatív monomerekre esik szét (NAD-kötő képesség megmarad)
• Kémiai módosítás
  Pl. lizinek töltésének megfordítása dibázikus sav anhidridjével való módosítással (reverzibilis!). Pl. élesztő zsírsav-szintetáznál (a₆b₆) bevált.
• Ligandumindukált disszociáció
  Bizonyos speciális esetekben. Pl. glutamát dehidrogenáz (hexamer) GTP hatására szétesik; cAMP-függő protein kinázról cAMP hatására a katalitikus egység leválik
• Enyhén denaturáló körülmények (esetleg stabilizálószer egyidejű alkalmazásával)
  
  • Triptofán szintáz (a₂b₂) KSCN hatására
  • Laktát dehidrogenáz (tetramer) 1M glicin/H₃PO₄+EDTA, pH 2,3, plusz 1M Na₂SO₄ stabilizáló só hatására
  • Laktát dehidrogenáz 2M ureában v. 0,8-1,2M GdmCl-ben dimerekre esik szét
  • Glutamát dehidrogenáz (hexamer): 1-1,5M GdmCl-ben két natívszerű trimerre esik szét, 3M-nél ezek is szétesnek és legombolyodnak
    
    (kör: M_r fényszórással mérve; háromszög, négyzet: másodlagos és harmadlagos szerkezet CD-vel, ill. fluoreszcenciával mérve)
• Nagy nyomás
  >1 kbar nyomás hatására az oligomerek gyakran szétesnek (pl. laktát dehidrogenáz), mert ezzel csökkenhet a térfogat (oldószer hozzáfér az eddig eltemetett részekhez)

Az asszociáció nyomonkövetése: Biofizikai módszerek fehérje-fehérje kölcsönhatások mérésére

• Surface Plasmon Resonance (felületi plazmonrezonancia)
  
  • A kötő alegységeket egy optikai chip felületén immobilizáljuk.
  • A fölötte lévő pufferbe bevisszük a kötődő molekulát
  • Kötéskor a tömegváltozás optikai változást okoz, ezt méri a műszer
  • BIAcore: áramló puffer, Affinity Sensors: kevert puffer
  • Alkalmas: kötődik/nem kötődik eldöntésére, kötési affinitás mérésére
• Izotermikus titrációs kalorimetria
  
  • A kötő alegységek oldata van a mérőtérben
  • Ehhez injektáljuk kis adagokban a másik alegység oldatát
  • A műszer a felszabaduló hőt méri, a hőmérsékletet állandó értéken tartva
    
    
  • Számítható: kötési entalpia, asszociációs állandó, entrópia
  • Homooligomernél: üres pufferbe tömény fehérjeoldatot injektálgatunk, higítási hőket mérve
• Fluoreszcencia
  Ált. fluoreszcenciás rezonancia-energiatranszfer (FRET) segítségével mérhető a két alegység távolsága:
  Ha egy fluorofor (donor) emissziós spektruma átfed egy közeli fluorofor (akceptor) abszorpciós spektrumával, köztük rezonanciás energiatranszfer lép fel, melynek hatékonysága:

  E = R₀⁶/(R⁶ + R₀⁶), ahol
  R₀ = 979(K²QJn^-4)^1/6, ahol

  • K a dipól-dipól orientációs tényező
  • Q a donor kvantumhatásfoka transzfer hiányában
  • J a spektrumok átfedési integrálja
  • n az oldószer törésmutatója

  Hátrány: ált. fluoroforokat kell bevinni, ezek nagyméretű csoportok, amelyek az asszociációt is befolyásolhatják!

• Tömegspektroszkópia
• Fényszórás
  
  • Az átlagos részecskeméretet méri
  • Disszociációnál jól használható, asszociációnál az aggregáció miatt kevésbé
  • A turbiditás spektroszkópiával is mérhető (megfelelő korrekciók alkalmazásával)
• Gélszűrés HPLC-vel
  (A HPLC elég gyors, 1 órán belül elvégezhető)

Az összeszerelődés időbeli nyomon követésének módszerei

• Keresztkötés és SDS-PAGE (nagyágyú!)
  
  
  
  • A visszagombolyítás folyamatában bizonyos időpontokban mintát veszünk, azt gyorsan ható keresztkötő reagenssel elkeverjük, ez az oligomereket rögzíti
  • SDS-PAGE (poliakrilamid gélelektroforézis SDS detergensben) elemzés szétválasztja a különböző tömegű molekulákat
  • Legjobb keresztkötő reagens:
    
    glutáraldehid: OHC-CH₂-CH₂-CH₂-CHO

    Lizineket köti össze

  • Mindig ki kell kísérletezni, mi a legjobb glutáraldehid-koncentráció
  • Hátrány: Néha nincs elég lizin megfelelő helyen

  Eredmények élesztő foszfoglicerát mutáznál:

  
  (kör: monomer, háromszög: dimer, négyzet: tetramer)

  Csak dimer intermedier figyelhető meg.

• Hibridizáció izoenzimmel vagy módosított alegységekkel
  
  
  
  • A visszagombolyítás folyamatában adott időpontban nagy mennyiségben izoenzim-alegységeket vagy kémiailag módosított alegységeket adunk az oldathoz
  • Az idegen alegységek lekötik a még szabad molekulákat
  • Natív gélelektroforézissel elemezzük az eloszlást
  • Feltétel: az idegen alegység elektroforetikusan különbözzön a vizsgálttól
  • Problémák: az idegen alegység lassú felgombolyodása, disszociáció, stb.
  • alkalmazták pl. kreatin kináznál, aszpartát karbamoiltranszferáznál
• Reaktiváció mérése
  
  • Gyors aktivitásmérések alapján
  • Fehérjekoncentráció függvényében
  • Malát dehidrogenáznál:

    (az egyes görbék más-más fehérjekoncentráció mellett készültek, a fehérjekoncentráció alulról fölfelé növekszik; a grafikonon 2 óránál időskála-váltás)

Az adatok elemzése

• Elvégezzük: Keresztkötés és SDS-PAGE, valamint reaktivációs mérések, sokféle fehérjekoncentráció mellett (kiegészítve spektroszkópiai mérésekkel)
• Az adatok alapján felállítható egy reakcióséma, a sebességi állandók kiszámíthatóak.
• A reakcióséma unimolekuláris (izomerizációs) és bimolekuláris (asszociációs) lépésekből áll. Pl. tetramernél:
  4M_u --> 4M --> 2D' --> 2D --> T' --> T

  (M: monomer, D: dimer, T: tetramer)

• Rendszerint a reakcióegyenletek analitikus vagy numerikus megoldásával ellenőrizzük a modell és a paraméterek helyességét, ill. számítjuk ki a sebességi állandókat.

Példák többalegységes fehérjék összeszerelődésére

UDP-glükóz dehidrogenáz

Hexamer.

[Keresztkötésből hexamerek (hatszög), tetramerek (négyzet), trimerek (háromszög), dimerek (félkörök), monomerek (kör) mennyisége. Reaktiváció (teli hatszög).]

• Trimereket és pentamereket nem lehet megfigyelni
• Az aktivitás visszanyerése a hexamerképződéssel párhuzamos
• Reakcióséma:
  6M_u --> 6M --> 3D --> Hexamer
• Az első két lépés sebességi állandói: k₁=4,5x10^-4 s^-1 (elsőrendű) és k₂=1,6x10⁴ M^-1s^-1 (másodrendű)

Aszpartokináz-homoszerin dehidrogenáz (AK-HBH)

(E. coli)

• Tetramer
• Bifunkciós enzim, négy bifunkciós alegység
• Treonin bioszintézisének két korai lépését katalizálja
• Treonin allosztérikusan gátolja
• Mérések:
  
  [háromszögek: CD, fluoreszcencia; teli kör: kináz aktivitás, X: dehidrogenáz aktivitás; üres kör: a kináz aktivitás allosztérikus gátlása treoninnal]
• Reakcióséma:
  4M_u-->4M'-->4M-->2D'-->2D-->T

  	4Mu	4M'	4M	2D'	2D	T
  Kináz aktivitás	-	-	+	+	+	+
  - gátolhatósága treoninnal	-	-	-	-	-	+
  Dehidrogenáz aktivitás	-	-	-	+	+	+
  - gátolhatósága treoninnal	-	-	-	-	+	+
  Natív fluoreszcencia	-	+	+	+	+	+
  Natív távoli UV CD	-	+	+	+	+	+

Versengő mellékreakciók

• Alacsony fehérjekoncentrációnál:
  
  • az asszociációs lépések lelassulnak
  • a nemasszociált alegységek hosszú ideig fennmaradnak
  • csökkent stabilitásuk miatt veszélyeknek vannak kitéve: degradáció proteázszennyezés által, kémiai módosulás, edény falára tapadás, stb.
• Magas fehérjekoncentrációnál:
  Aggregáció következhet be: valamelyik korai intermedier hidrofób felszínei révén (általában nemspecifikus) asszociáció

Tehát a közepes koncentrációk az ideálisak

Laktát dehidrogenáz reaktiválhatósága a fehérjekoncentráció függvényében

(alkalmazások: ld. következő előadás)