A rácsmodell. Szabadenergia-felületek.

A spinüveg-modell

(Bryngelson és Wolynes 1987)

• Megfigyelés: a fehérjék bonyolultan viselkednek:
  • Egyes fehérjék fázisátalakulás-szerűen, éles átmenetben gombolyodnak fel, mások köztes állapotokkal (félregombolyodott állapotok, olvadt gombócok).
  • A felgombolyodás kinetikája komplex, multiexponenciális, időben sok nagyságrendet ölel fel. A lassú felgombolyodás sok lokális energiaminimum jelenlétére utal.
  • Előfordul irreverzibilis denaturáció, a fehérjék "öregedése".
• Mindez emlékeztet az üvegek tulajdonságaira
• Spinüveg: Mágneses spinekből álló rendszer, véletlenszerűen elosztott ferromágneses (spineket párhuzamosan beállítani igyekvő) és antiferromágneses (spineket ellentétesen beállítani igyekvő) kölcsönhatásokkal
• A spinüvegek jellemzői:
  • Bonyolult, sok lokális minimummal rendelkező energiafüggvény
  • Frusztráció: A kölcsönhatások csatoltsága miatt nem lehet mindegyik kölcsönhatást egyszerre kielégíteni. (Pl. három spinből álló rendszer, mindegyik pár között antiferromágneses kapcsolattal.)
  • Üvegátmenetek. A hőmérséklet csökkentésekor a rendszer valamelyik lokális energiaminimumba befagy. Hogy melyikbe, az a rendszer előtörténetétől, ill. részben a véletlentől függ.
• Bryngelson és Wolynes modellje: A fehérje energiafüggvénye (egyszerűsített modellre értelmezve):

  

  ahol epszilon_i(alfa_i) az alfa állapotban lévő, i-edik aminosav saját energiája, J_i,i+1(alfa_i,alfa_i+1) két szomszédos aminosav kölcsönhatása (lokális kölcsönhatás), K_i,j(alfa_i,alfa_j,r_i,r_j) a távol lévő i. és j. aminosav (nemlokális) kölcsönhatása, amely a helykoordinátáiktól is függ. Ez matematikailag egy spinüveg energiafüggvénye.
• Az elemzésből adódik a fehérjék fázisdiagramja:

  

  deltaE: az energiafelület hepehupássága, T: hőmérséklet, E_S: stabilitási hézag: a natívközeli és attól távoli állapotok közötti energiakülönbség

  A fázisdiagramon szerepel a teljesen legombolyodott állapot (random coil), a felgombolyodott állapot, valamint az összeesett, de képlékeny állapot (egyfajta olvadt gombóc). Alacsony hőmérsékleten, nagy hepehupásság esetén fellép egy negyedik állapot: üvegszerűen befagyott állapot.
• Az üvegállapot kísérletek szerint számos fehérjénél fellép 200 K körüli hőmérsékleten (a konformációs fluktuációk jellege megváltozik).
  
• Frusztráció a fehérjékben: számos kölcsönhatásnak (hidrofób kontaktusok, hidrogénkötések, stb.) kellene egyszerre létrejönni, ami lehetetlen.
• Minimális frusztráció elve (Bryngelson és Wolynes): a natív állapot az, amelyik minimális mértékben frusztrált. A szekvenciatérben értelmezve: a minimálisan frusztrált szekvenciák képesek jóldefiniált natív szerkezetet felvenni.
• Az energiafelület hepehupássága: A fehérjék egyszerre mutatják az egyszerű rendszerek és a komplex, spinüveg-szerű rendszerek tulajdonságait. Magyarázat: a felgombolyodásképes fehérjék energiafelületén a lokális minimumok nem véletlenszerűen helyezkednek el, mint a spinüvegeknél általában, hanem egy durva oldalú tölcsért képeznek, amely viszonylag hatékonyan vezérli a rendszert a natív állapotnak megfelelő minimum felé.

  

• Ez a kép alapozta meg a felgombolyodás "új szemléletét", s ez inspirálta a 90-es évek elejétől a rácsmodellek kifejlesztését.

A rácsmodellek típusai

Rácsmodell: "önelkerülő" gyöngysor, rácspontokon

• HP modell (Hidrofób-Poláros) [Ken A. Dill és mások]
  • Kétféle aminosav: Hidrofób és Poláros (kétbetűs kód)
  • 2D és 3D modellek. Eredményeik hasonlóak; a 2D modellek könnyebben számíthatóak. Hidrofób maggal rendelkező modell 2d-ben 16, 3D-ben 64 aminosavból készíthető.
  • Egyparaméteres: epszilon kontaktenergia (a HH kontaktus energiája)
  • A kontaktusok energiája:
    (E_HH, E_HP, E_PP)=(-epszilon, 0, 0)
• Perturbált heteropolimer modellek [Eugene I. Shakhnovich és mások]
  • Erős vonzás a monomerek között, gyenge variációval
  • Többnyire 27-mer, alapállapota 3x3x3-as kockán (103 346 lehetséges állapot)
  • Két változat:
    • Független kontaktenergiák: E(i,j)=B_i,j
    • Kétbetűs kód: A,B. Ált. E_AB>E_AA,E_BB. (Ált. nem mag-felszín szeparációhoz, hanem jobb-bal elkülönüléshez vezet.)
  • Bírálat Dilltől: nem elég jó modell (valódi fehérjékre nem teljesülnek a felsorolt tulajdonságok)

Ken Dill (UCSF)	Eugene Shakhnovich (Harvard)

A rácsmodellek előnyei és hátrányai

Előnyök

• Szekvenciatér és konformációtér teljességében felderíthető
• Egzaktul kiszámítható mennyiségek! (Jobb az egyszerű, de egzaktul számolható modell, mint a bonyolult, de csak közelítőleg számítható.)
• Nem csak fehérjékre vonatkoztatható
• Használható analitikus elméletek tesztelésére (mint spinüveg-modell, átlagtér-elméletek)
• Használható konformációkereső algoritmusok tesztelésére

Hátrányok

• Az atomi felbontás hiánya
• A szerkezeti és energetikai részletek nem pontosak
• A lánc sokszor irreálisan rövid

A rácsmodellek elemzése

• Enumeráció: a modell összes lehetséges állapotának előállítása, megszámlálása és jellemzése. Kisebb modelleknél járható.
• Monte Carlo mintavétel: Monte Carlo módszerrel (véletlenszerű generálás) véletlen állapotok előállítása, ebből statisztikai számítás. Nagyobb modelleknél. (Hibalehetőségek vannak, pl. rossz becslésekből.)
• A natív állapot megkeresése: Kisebb modelleknél az összes lehetséges állapot végigpróbálásával, nagyobbaknál becslés speciális algoritmusokkal. A HP modellek alapállapotának megkeresése ún. NP-nehéz feladat (a megoldáshoz szükséges idő a lánchossznak nem polinomiális [hanem annál gyorsabban növekvő] függvénye).

Egyszerű rácsmodellek

Négytagú játékmodell

• Legegyszerűbb 2D HP rácsmodell, szekvencia: HPPH
• h db kontaktusnál az energia -h epszilon
• Termodinamikai jellemzés:

  

• A paraméterek hőmérsékletfüggése:

  

  A: Natív populáció részaránya, B: deltaG felgombolyodási szabadentalpia. T_m olvadáspontnál a natívhányad 50%, a szabadentalpia nulla. A szabadentalpia-függvény lineáris (valódi fehérjéknél görbült)

  

  A: energia, B: hőkapacitás. A hőkapacitás-görbe jellegzetes átmeneti csúcsot mutat

• Már ez a legegyszerűbb modell is mutatja a fehérjék egyes termodinamikai tulajdonságait

Hattagú játékmodell

• Hattagú 2D HP modell, szekvencia: HPHPPH
• Termodinamikai elemzés: mint a négytagúnál
• Három energiaszint: három állapot
• Populációeloszlások a hőmérséklet függvényében:

  

  A populáció a tisztán natív állapotból indulva a köztes állapoton át folyamatosan áttolódik a denaturált állapotra

• Felgombolyodási szabadentalpia a hőmérséklet függvényében:

  

  Az intermedier állapot miatt már nem lineáris, hanem görbül, mint a valódi fehérjéknél. Ha epszilont hőmérsékletfüggővé tesszük (a hőmérséklet csökkenésével csökken, akárcsak a hidrofób kölcsönhatás), a szaggatott vonallal jelzett görbét kapjuk. Ez mutatja a valódi fehérjékre jellemző, parabolaszerű görbét, a hidegdenaturációval.

• Egy egyszerű hattagú modell már a fehérjék szabadentalpia-görbéjét is jól modellezi

Húsztagú modellek

A szekvenciától függően sokféle viselkedés:

• epszilon a hidrofób kölcsönhatás erősségét jellemzi, epszilon/kT a denaturálószer-koncentrációnak feleltethető meg
• (ii) és (iii) fehérjék éles átmenetet mutatnak, (i) kétcsúcsú, széles átmenetet: kétdoménes fehérje
• A (ii) modell populációeloszlása a hőmérséklet függvényében:

  

  T=0,3-nál és T=0,4-nél a natív (N) és denaturált (D) populációk jelentősek, köztük jelentéktelenebb populáltságú köztes állapottal (az eloszlásnak minimuma van). Ez a kétállapotú kooperativitás.

• Egy húsztagú modell már kétállapotú kooperativitást képes mutatni, mint a valódi fehérjék
• A modell natív állapota egy béta-lemezt és két hélixet tartalmaz, hidrofób maggal, poláros felszínnel

Rácsmodellek natív állapotai

• Nem minden HP szekvenciának van egyetlen natív állapota (egyetlen natív állapot: g_N=1)
• Adott hosszúságú HP szekvenciák közül az egyetlen natív állapottal rendelkezők százalékos aránya:

  

  A 10-nél hosszabb szekvenciáknak csak mintegy 2-3%-a rendelkezik egyetlen natív állapottal. Tehát igen speciális szekvenciákról van szó.

Egyetlen natív állapottal rendelkező szekvenciák tervezése

• Adott térszerkezethez könnyű olyan szekvenciát tervezni, amelynek a térszerkezet alacsony energiájú állapota
• Jóval nehezebb viszont biztosítani, hogy az adott szekvencia ne vehessen fel más, szintén alacsony vagy még alacsonyabb energiájú állapotot. Ez a negatív tervezés.
• Példa:

  

  A: Shaknovichék tervezte szekvencia a képen látható térszerkezetre. Monte Carlo módszerrel dolgozva csak a maximálisan kompakt (kocka formájú) állapotokat vizsgálták
  B: Dillék a saját kereső algoritmusukkal kimutatták, hogy az adott szekvenciának van egy még alacsonyabb energiájú állapota, ami viszont nem maximálisan kompakt
• 20 aminosav esetén az egyetlen natív állapotot könnyebb megvalósítani, mint 2-nél

Oldalláncok

Mi az oldalláncok szerepe a natív szerkezet specificitásának meghatározásában?

• Puzzle-modell: A natív térszerkezetet az tünteti ki, hogy az oldalláncok pontosan illeszkednek, mint egy puzzle darabjai. Az olvadt gombóc állapot lényege az, hogy már kész a szerkezet, csak még az oldalláncok összeilleszkedése hiányzik
• Csavarok és anyák modell: Az oldalláncok nem kirakós játék részeiként illeszkednek, hanem úgy töltik ki a teret, mint egy dobozban egy rakás csavar és anya, vagyis nem specifikusan; átrendeződések lehetségesek
• Illusztráció:

  

• Melyik modell igaz? Shaknovichék szerint a puzzle, Dillék szerint a "csavarok és anyák"
• Eldöntés: Hogyan függ az oldalláncok entrópiajáruléka a kompaktságtól?
  • Puzzle-modell: A molekulát tágítva a szoros illeszkedés miatt jó ideig semmi sem történik, majd egy ponton ugrásszerűen megnő az oldalláncok rotációs szabadsága
  • Csavarok és anyák: Tágításkor folyamatosan nő az oldalláncok rotációs szabadsága, nincs ugrásszerű változás

  

• Kísérleti adatok mindkét modell mellett és ellen felhozhatóak
• Vizsgálat rácsmodellel: oldalláncokkal bővített rácsmodell

  

• Ezekkel dolgozva az oldalláncok entrópiajáruléka a kompaktság függvényében:

  

  A: 16 és 50 tagú 2D HP modellek, B: 10 és 50 tagú 3D HP modellek

• Eredmény: A kompaktság növelésével rohamosan csökken az entrópia, befagynak az oldalláncok. Az oldalláncok és a gerinc szabadsági fokai erősen csatoltak; csak az oldalláncaiban megolvadt gombóc nem képzelhető el. Ez a "csavarok és anyák" modellt támasztja alá.

Rácsmodellek felgombolyítása

• Dinamika vizsgálatához (pl. Monte Carlo szimuláció) definiálnunk kell a konformációk közötti lehetséges átmenetek módozatait: mozgáskészletek.

  

  Kétféle Monte Carlo mozgáskészlet

• Ennek alapján egy 13 tagú 2D HP modell felgombolyodása:

  

• Két útvonal, egy gyors és egy lassú. A lassú útvonalon kinetikus csapda (lokális energiaminimum) van.
• Ez az egyszerű modell is komplex felgombolyodási kinetikát mutat (a lizozimhez hasonló)
• Monte Carlo szimulációval a populációk időfüggése:

  

  A számok az adott állapotban meglévő HH kontaktusok számát jelentik. Szaggatott vonal: meglévő hidrofób kontaktusok részaránya a natívhoz képest.

  Gyors hidrofób kollapszus (5 kontaktus gyors kialakulása), majd 5 nagyságrenddel hosszab időskálán lassú átrendeződés a natív állapotba.

• Jól mutatja a valódi fehérjéknél megfigyelt sajátosságokat

Mutációk hatása a felgombolyodásra

Hogyan hat egy H-->P mutáció a felgombolyodás sebességére?

Két azonos natív szerkezetű, csak egy elemben eltérő HP modellben mutációt végzünk (az eltérő elemtől távol):

• A: A mutáció gyorsítja a felgombolyodást, mert a felgombolyodás útvonalán a vad típusban fel kell szakítani egy HH kötést, a mutánsban viszont nem.
• B: A mutáció lassítja a felgombolyodást, mert a felgombolyodás útvonalán a vad típusban a H segít felbontani egy nemnatív HH kontaktust, a mutánsban a P ezt nem tudja megtenni, nő az energiagát nagysága.

Tehát ugyanolyan típusú mutáció lassíthatja vagy gyorsíthatja is a felgombolyodást, ahogy a valódi fehérjéknél is.

Szabadenergia-felületek

Rácsmodellek Monte Carlo szimulációiból számítható a szabadenergia:

ahol E az energia (a kontaktusok számából), S az entrópia (az adott energiájú állapotok számából számítható).

A szabadenergiát megfelelő mennyiségek mint koordináták függvényében ábrázolva szemléletes felületek adódnak. Ilyen mennyiségek pl.:

• C: az összes kontaktusok száma
• Q₀: a natív kontaktusok száma (olyan kontaktus, ami a natív szerkezetben is megvan)

Egy 27 elemű rácsmodell szabadenergia-felülete

A szimuláció menete ezen a felületen szemléltethető:

• A szimuláció random szerkezetből indul (kevés kontaktus): hozzáférhető állapotok száma kb. 10¹⁶
• Gyorsan összeesik egy kompakt szerkezetté, mely a lehetséges kontaktusok 60%-át tartalmazza, de a 60%-nak csak 25%-a natív kontaktus. A hozzáférhető állapotok száma kb. 10¹⁰.
• Itt egy széles minimum van a szabadenergiában
• Ezután lassú folyamat következik: a lánc keresi a natív állapot felé vezető átmeneti állapotot
• Átmeneti állapotok száma 10³
• Az átmeneti állapotból gyorsan betalál a natívba (1 állapot)
• Zöld, piros: lehetséges, különböző útvonalak. Sárga: átlag.

A lizozim szabadenergia-felülete

A lizozim felgombolyodásának menete kísérletből ismert. Ennek alapján szerkeszthető egy hipotetikus energiafelület, melynek koordinátái: Q_alfa és Q_béta: a natív kontaktusok száma az alfa, ill. béta doménben. A felület:

• A molekulák kb. 20%-a gyorsan felgombolyodik (sárga útvonal, <100 ms időállandó), natívszerű intermedierrel
• A molekulák kb. 70%-a jóval lassabban gombolyodik fel (piros útvonal, kb. 400 ms időállandó), olyan intermedierrel, amely csak az alfa doménben natívszerű
• A molekulák 10%-a nagyon lassan gombolyodik fel (prolinizomerizáció miatt, ezt nem jelöltük)
• Mindegyik út utolsó lépése a két, már kialakult domén asszociációja

Egy 125 elemű rácsmodell szabadenergia-felülete

• Két mennyiség mint koordináta: Q_c: a belső magban lévő natív kontaktusok (34 darab), Q_s: olyan kontaktusok, amelyek a legfontosabb intermedierben nincsenek benne (15 darab)
• A felgombolyodás menete:
  • Gyors összeesés, majd lassú keresés
  • A molekulák 15%-ában gyorsan kialakul a natív mag, majd közvetlenül a natív állapotba jut (sárga útvonal)
  • A molekulák 40%-a különféle nemnatív kontaktusokat létesít, így egy hosszú élettartamú intermedier alakul ki (piros útvonal), melyben két szubdomén van, egyikben a natív 5x5x5-ös kocka felső három síkja megvan, a másik a többi részből áll. Mindkét szubdomén eléggé felgombolyodott, de a köztük lévő kapcsolatok nem jöttek létre.
  • A maradék 45%-ban szintén rosszul kezd felgombolyodni, de gyorsabban áthidalja a dolgot (ezt nem jelöltük)

  ---

  A rácsmodellek következtetései

  (Elsősorban Ken Dill munkái alapján)

  • Bizonyos szekvenciájú rácsmodellek stabil, kompakt állapotokba esnek össze. Ezek számos tekintetben igen hasonlóak a fehérjékhez:
    • Kompakt, unikális natív szerkezet
    • Másodlagos és harmadlagos szerkezet
    • Apoláros mag, poláros felszín
    • Éles, szigmoidális, kooperatív átmenet
    • Kétállapotú kooperativitás
    • Kompakt, komplex denaturált állapotok
    • Többfázisú felgombolyodási kinetika
  • Szabadenergiafelületek, kinetikus komplexitás jól modellezhető