A fehérjék térszerkezetének jóslása

A probléma bonyolultsága

• Általánosságban: találjuk meg egy tetszőleges szekvencia azon konformációját, amely a szabadentalpia globális minimumát adja.
• Egyszerű modellekben kimutatható: a feladat ún. NP-nehéz, vagyis a megoldásához szükséges idő a (fehérje)mérettel nempolinomiális függvény szerint (hanem annál gyorsabban) növekszik. (Vagyis bizonyos mérethatár fölött nem megoldható.)
• Gyakorlatban:
  • a valódi fehérjék szekvenciái nagyon specifikusak (evolúció során kiválogatódtak);
  • a predikcióhoz felhasználhatjuk a már ismert térszerkezeteket mint tudásbázist
• A gyakorlatban tehát a probléma kezelhető.

A predikció szintjei

Jósolhatóak a fehérjeszerkezet egy-, két-, ill. háromdimenziós aspektusai:

• 1D: aminosavakhoz köthető tulajdonságok, melyek 1D stringként írhatóak fel. Pl.: szekvencia, másodlagos szerkezet, oldószer általi hozzáférhetőség, hidrofobicitás
• 2D: aminosavpárok közötti távolságok, kontaktusok
• 3D: az összes atomi koordináta

1D predikciók

Másodlagos szerkezet jóslása a szekvenciából

• 1. és 2. generációs módszerek: pontosság <70%, béta-szerkezetre csak 28-48%, túl rövid hélixek és béta-szálak.
  Miért pontatlanok? Szokásos magyarázat: mert nem veszik figyelembe a szekvenciában egymástól távol, de a térszerkezetben közel lévő aminosavak hatását a másodlagos szerkezetre.
• 3. generációs módszerek: több hasonló aminosavszekvencia többszörös összerendezésében rejlő információt használják fel.
  Miért pontosabbak? Az egymástól a szekvenciában távol, de a térszerkezetben közel lévő aminosavak gyakran mutálódnak egyszerre (korrelált mutációk), s ez az információ a többszörös szekvenciaösszerendezésekben megvan. A többszörös összerendezés tehát impliciten a térszerkezetre vonatkozóan is tartalmaz információt, ezáltal lehet pontosabb a másodlagos szerkezet jóslása.

PHD módszer (ma a legjobb, akár 77% pontosság) [Burkhard Rost]

1. adatbázisból kikeressük a rokon szekvenciákat (BLAST program)
2. Elkészítjük ezek többszörös összerendezését (MaxHom program)
3. Az összerendezés szűrése, jó homológok megtartása, újból összerendezés
4. A végső összerendezés alapján mindegyik pozícióra elkészítjük az előforduló aminosavcserék profilját
5. Ez szolgál bemenetként a neuronhálózatnak

Oldószer általi hozzáférhetőség predikciója

• Felszíni vagy eltemetett az oldallánc
• Kezdetleges predikció: az oldallánc hidrofobicitása alapján --> gyenge eredmény
• Jobb predikció: evolúciós információ bevitele többszörös összerendezések útján --> 75% pontosságú jóslás (PHDacc)

Transzmembrán hélixek predikciója

• Három állapot: bent, kint, membránban
• Több módszer; a többszörös összerendezést használók itt is eredményesek (>95% pontosság)
• Legpontosabb: rejtett Markov-modell (Tusnády G.): közel 100%

2D predikciók

Oldallánc-kontaktusok predikciója

• Az összes kontaktusból elvben felépíthető a 3D szerkezet
• Próbálkoztak kontaktusokat jósolni a következők alapján:
  • szekvenciában távoli aminosavak együtt előforduló (korrelált) mutációi
  • statisztika
  • átlagtér-potenciálok
  • neuronhálózatok
• Az eddigi eredmények nem kielégítőek

3D predikciók

CASP-ok

• CASP: Critical Assessment of Methods of Protein Structure Prediction (fehérjeszerkezet-jóslási módszerek kritikai felülvizsgálata): kétévenként megrendezett "verseny" a predikcióval foglalkozó kutatócsoportok között
• CASP1 (1994), CASP2 (1996), CASP3 (1998), CASP4 (2000).
• CAFASP1 (1998), CAFASP2 (200): FA=Fully Automated: teljesen automatikus módszerek ellenőrzése
• Forgatókönyv:
  • Röntgenes és NMR-es csoportoktól begyűjtik azon fehérjék szekvenciáit, melyek szerkezete várhatóan rövidesen ismertté válik
  • a kutatócsoportok néhány hónap alatt ezekre predikciókat küldenek be
  • decemberben (mikor már megvanak a kísérleti szerkezetek) összeülnek és megbeszélik az eredményt; a legsikeresebb jósok előadást tartanak; a Proteins c. folyóirat különszámot ad ki (a következő év októbere táján, tehát a CASP4 eredményeit még nem közölték).

Három kategória

• Homológiamodellezés (komparatív modellezés): ha a szekvenciánkhoz van ismert térszerkezetű, a szekvenciánkkal számottevő szekvenciaazonosságot (> 20%) mutató homológ, akkor annak térszerkezete alapján építhetjük fel a mi szekvenciánk jósolt térszerkezetét.
• Gombolyfelismerés (fold recognition): alacsony szekvenciaazonosság mellett meg kell találni, van-e az ismert térszerkezetek között a szekvenciánkkal kompatibilis gomboly, s melyik az. Ha találtunk ilyet, akkor homológiamodellezéssel szerkezet is építhető.
  Emlékeztető: gomboly alatt (az angol fold szó fordítása) a fehérje nagy vonalakban vett szerkezetét, a polipeptidlánc gerincének hozzávetőleges térbeli lefutását értjük. A hasonló szerkezetű fehérjék tehát azonos gombollyal rendelkeznek.
• Ab initio predikció: nincs számottevő szekvenciaazonosság ismert térszerkezetű fehérjével, s nincs kompatibilis gomboly sem, tehát a szekvenciánkhoz tartozó gomboly ismeretlen. A térszerkezet-predikció ilyenkor fizikai elvek felhasználásával történhet.

A predikció várható sikeressége

• A szekvencia-adatbázis gyorsabban növekszik, mint a térszerkezeti adatbázis
• Térszerkezet jobban konzerválódott, mint a szekvencia: két fehérje 30%-os szekvenciaazonossága esetén térszerkezetük nagyon hasonló. 20-30% között (szürkületi zóna) a hasonlóság kérdésessé válik, de még 10% alatti szekvenciaazonosság esetén is előfordulhat
• Térszerkezet-jóslás legjobban használható módszerei:
  • Homológiamodellezés: ha az ismeretlen térszerkezetű fehérje szekvenciája >20-25% azonosságot mutat egy már ismert térszerkezetűével, akkor jó közelítő modell építhető
  • "Gombolyfelismerő" (fold recognition) eljárások: az esetek egy részében kisebb szekvenciaazonosság esetén is azonosítják a "gombolyt", ezután pedig a homológiamodellezés már alkalmazható a megtalált hasonló térszerkezet felhasználásával.
• Adott szekvencia mekkora valószínűséggel modellezhető a fenti eljárásokkal? Attól függ, honnan vesszük a szekvenciát:

  

  (HoMo: homológiamodellezés, FoRc: fold recognition [gombolyfelismerés], UFo: unknown fold [ismeretlen gomboly], UFo+FoRC: határeset)

  • PDB erősen redundáns: a benne lévő szerkezetek 58%-a modellezhető lenne más ismert szerkezetek alapján
  • SWISS-PROT szekvenciaadatbázis szintén torz: a benne lévő szekvenciák kb. 30%-ára lehetne homológiamodellezéssel modellt építeni
  • Újonnan megszekvenált genomok fehérjéi: csak kb. 10%-ra lenne építhető homológiamodell; kb. 40% felismerhető lenne gombolyfelismeréssel, a többi 50% teljesen új szerkezet
• Szerkezeti genomika: célja, hogy a genomban kódolt fehérjék közül kiválogassa azokat a fehérjéket, amelyek szerkezetét kísérletesen (röntgen, NMR) meghatározva az összes többi fehérje homológiamodellezhetővé válik

Homológiamodellezés

A homológiamodellek rendkívül hasznosak kísérletek tervezéséhez, hipotézisek felállításához, stb.

Hagyományos módszer: lánctöredékek összeszerelése

Kiindulás:

• referenciafehérjék (más néven: templátok vagy anyaszerkezetek): a modellezendő fehérje szekvenciájával jelentős azonosságot mutató fehérjék ismert szerkezete
• "Új" fehérje (más néven: célfehérje): a modellezendő fehérje, melynek csak a szekvenciája ismert

A három fehérjét egymásra illesztjük, így kitűnik, melyek a szerkezetileg konzerválódott régiók (SCR-ek) és a variábilis régiók (VR-ek):

A három fehérje szekvenciáját a térszerkezetek fedése alapján összerendezzük, majd hozzárendezzük az új fehérje szekvenciáját:

Az új fehérje felépítése: az SCR-eket bármelyik referenciafehérjéből átvehetjük:

A VR-eket egyenként megvizsgáljuk. A referenciafehérjék megfelelő VR-jei közül kiválasztjuk a legilleszkedőbbeket. Ha nincs megfelelő, akkor adatbázisban keresünk odaillő hurkot.

Így előáll a durva modell, mely darabokból van összeszerelve. Energiaminimalizálással finomítható.

• Oldalláncok modellezése: az oldalláncokat ki kell cserélni a célfehérjének megfelelőre. Konformációjuk beállítása: a templátfehérjékből átvenni, amennyire lehet, ill. különféle optimalizálási eljárások (pl. rotamerkonformációkkal)
• Hurkok modellezése: ha a templátfehérjék között nincs megfelelő, akkor hurokadatbázisban keresünk megfelelőt, vagy valamilyen konformációkereső eljárást alkalmazunk
• A modell pontossága: az SCR-ek közepén a legpontosabb, a hurkokban a legpontatlanabb

A térbeli kényszerek kielégítésén alapuló módszer

• MODELLER program (Andrej Sali)
• A templátszerkezetekből térbeli kényszereket vezet le a célszerkezetre vonatkozóan (pl. atompárok távolsága, atomhármasok szöge, stb.)
• A kényszereket egy célfüggvénybe egyesíti, majd random kiinduló szerkezetből kiindulva szimulált hőkezeléssel optimalizálja
• Jó minőségű szerkezeteket állít elő, kevés sztereokémiai hiba

Homológiamodellezés a CASP3-on

• Alkalmazott módszerek: a fenti módszerek kombinációi, speciális algoritmusokkal bővítve, sok helyen emberi beavatkozással
• Sikeresség:

  

  X: szekvenciaazonosság a templáttal, Y: rmsd a valódi szerkezettől

  rmsd: root mean square deviation, két szerkezet egymástól való különbözőségének mértéke, tkp. az egymásnak megfelelő atomok közötti távolságok négyzetes közepe.

  Látható: kb. 30% szekvenciaazonosság fölött igen jó modell építhető

• A nagyobb, templát nélküli hurkok és az oldalláncok modellezése nem kielégítő pontosságú
• Legkritikusabb tényező: a szekvencia-szerkezet összerendezés.
  • Az összerendezést nagyon gondosan kell elkészíteni, pl. figyelembe véve a templátszerkezetekben konzerválódott H-kötéseket, kontaktusokat, stb.
  • Az elkészült modellt megvizsgálva az összerendezésen javítani lehet, s annak alapján jobb modellt építeni

Gombolyfelismerés

• Távoli homológok (<25% szekvenciaazonosság) gyakran azonos gombollyal rendelkeznek. A feladat ennek felismerése
• Két dolog kell hozzá:
  • Egy "gombolykönyvtár", ami az ismert térszerkezeteket (gombolyokat) tartalmazza valamilyen formában.
  • Egy összehasonlító módszer, amellyel meg tudjuk állapítani, hogy egy adott szekvencia mennyire illeszthető, húzható rá egy adott térszerkezetre
• A módszer: a szekvenciánkat egyenként az összes gombollyal összehasonlítjuk, hogy megtaláljuk, van-e köztük olyan, amit a szekvenciánk felvehet.
• Általános eljárás: felfűzés (threading): az ismeretlen szerkezetű fehérje szekvenciáját valamiképpen "fel kell fűzni" az ismert térszerkezetekre, és valamilyen potenciálfüggvénnyel értékelni kell a szekvencia és a szerkezet illeszkedését
  • Korábbi eljárások: az oldalláncok környezetét vették alapul (környezet polaritása, eltemetettség, másodlagos szerkezet, stb.)
  • Újabb eljárások: a párpotenciálokon van a hangsúly (az ismert térszerkezetekben található aminosav-aminosav kontaktusok alapján levezetett potenciálfüggvények)

Felfűzés a CASP3-on

• A hat legeredményesebb csoport módszerei:
  • Három csoport (Jones, Sippl, Bryant) párpotenciálokon alapuló pontozófüggvényt alkalmazott, kiegészítésekkel:
  • Jones csoportja és Sippl csoportja (ProFIT program): a potenciálfüggvény az aminosavpárok szekvenciabeli és térbeli távolságától is függ; továbbá a jósolt másodlagos szerkezetet is figyelembe veszik
  • Bryant: a kontaktpotenciálokon felül az ismert térszerkezetekben talált, konzerválódott hidrofób magok ismeretére is támaszkodott
  • K. Karplus: tisztán szekvencia alapú módszer, ún. rejtett Markov-modell
  • Nishikawa, Koretke csoportjai: sokféle módszer kombinációját alkalmazták, ezek alapján konszenzus
• Eredmények:

  

  A legjobb gombolyfelismerési predikciók. X: a fehérje hossza; Y: az 5 angströmnél kisebb rmsd-vel (a valódi szerkezettől való eltérés) prediktált aminosavak száma

• Látható: az eredmény vegyes. Néhány fehérjére jó a predikció, a többségre elég rossz, némelyikre csapnivaló
• A felfűzési módszerek egyelőre nem kielégítőek (egyetlen módszer sem képes az esetek >40%-ában helyes eredményt adni)

Távoli homológiák felismerése

Ha szekvenciahasonlóság alapján a szekvenciánkhoz nem találunk ismert térszerkezetű homológot, akkor segíthet egy olyan módszer, amely távoli homológokat is megtalál, s ezek között lehet egy olyan, ismert térszerkezetű homológ, amelyet fel tudunk használni a térszerkezet-jósláshoz. A gombolyfelismerés is tkp. távoli homológiát detektál (felismeri a rokonságot két fehérje között az alacsony szekvenciabeli hasonlóság ellenére).

• A probléma másik megközelítése: tisztán a szekvenciák alapján dolgozunk
• PSI-BLAST program (Position Specific Iterated Basic Local Alignment Search Tool): a BLAST összerendezés-kereső program kiterjesztése:
  • Előbb egy hagyományos BLAST kereséssel kigyűjti egy szekvencia homológjait, ezekből többszörös összerendezést készít
  • A többszörös összerendezésből elkészít egy szekvenciaprofilt
  • A szekvenciaprofillal újból keresést végez a szekvenciaadatbázison
  • Ezáltal távolabbi homológokat is megtalál
• A PSI-BLAST a felfűzési módszerekkel összemérhető hatásfokkal találja meg a távoli homológokat, így a gombolyfelismerés versenytársa lehet.

Ab initio térszerkezetjóslás

CASP3

A célszerkezetek:

Az alkalmazott módszerek

Nincs standard eljárás. Sokféle, egyedi módszer:

• Skolnick és mtsai: többszörös szekvenciaösszerendezésekből kényszerfeltételeket vezettek le a másodlagos és harmadlagos szerkezetre [kontaktusok] nézve. Ezután rácsmodellként szimulálták a fehérje felgombolyodását; 1000 szimuláció közül a legalacsonyabb energiát eredményezőt tekintették végleges modellnek
• Scheraga és mtsai: "egyesített-atom" modellben (csak alfa-szénatomok) konformációkeresés, majd "összes-atom" modellben finomítás
• Osguthorpe: egyszerűsített fehérjemodell, molekuladinamikai szimulált hőkezelés
• Levitt és mtsai: tetraéderes rácsmodellként generálták az összes lehetséges konformációt, majd a legalacsonyabb energiájúakat alapul véve, másodlagosszerkezet-jóslást is felhasználva, áttértek "összes-atom" modellekre, ezeket egy komplex pontozófüggvénnyel értékelték
• Mosberg és mtsai: másodlagosszerkezet-jóslás után manuálisan illesztgették össze a másodlagos szerkezet elemeit, hogy eltemetődjenek a hidrofób felszínek
• Baker és mtsai: 3-9 aminosav hosszúságú fragmentumokra kerestek modelleket az ismert szerkezetek adatbázisában, majd ezeket összeillesztették, egy energiafüggvénnyel értékelték, majd a szemre legjobban kinéző mellett döntöttek

Eredmények

• Több csoportnak sikerült >30 aminosavas fragmentumokat jó közelítéssel jósolni (< 4 angström rmsd)
• Az alfa és az alfa-béta típusú fehérjék architektúráját többnyire jól megközelítették

  

• A tudás alapú (ismert szerkezetek adatbázisára támaszkodó) módszerek jobban teljesítettek, mint a fizikai alapú módszerek
• Egészében véve komoly előrelépés van a CASP2-höz képest

CAFASP1

• Teljesen automatikus gombolyfelismerési módszerek tesztje
• Eredmény: jóval gyengébben működnek, mint emberi beavatkozással

További kilátások

• CASP4: már lezajlott, de még nem közölték az eredményeket.
• Nagyobb szabású predikciós projektek kezdődtek a szerkezeti genomikai programok kapcsán
• Már van MODBASE modelladatbázis, mely folyamatosan bővül. A kísérletes szerkezetek meghatározásával párhuzamosan ellenőrizhetők a modellek